鼻咽癌放疗患者血清miR-196a表达的临床意义

　　摘要：目的：MicroRNAs(miRNAs)属于非编码蛋白基因,是一类负调控基因表达的小RNA,血清中miRNAs具有重要临床意义。为探讨miR-196a在NPC中表达的临床意义,本研究分析血清miR-196a表达水平与NPC放疗反应的相关性。方法：收集选取中南大学湘雅医院2010年6月—2019年6月接受调强放疗并有完整随访资料的NPC患者138例作为研究的实验组,同期选取来院健康检查的正常人62例作为对照组。对照组采集空腹静脉血,所有患者均于放疗前采集空腹静脉血,实时荧光定量PCR(qPCR)检测血清miR-196a表达水平;分析血清miR-196a高表达与NPC患者临床分期及无病生存期(DFS)的相关性。以实体瘤变化和随访结果为评判标准,根据疗效将患者分为A组(放疗癌灶完全缓解)和B组(放疗癌灶部分缓解+放疗癌灶稳定进展);进而分析血清miR-196a表达水平与NPC疗效的关系。结果：138例NPC患者miR-196a在血清中高表达122例(88.41%);其中86例临床分期Ⅲ、Ⅳ期NPC患者血清miR-196a高表达81例,16例临床分期Ⅰ期NPC患者血清miR-196a高表达14例,36例临床分期Ⅱ期NPC患者血清miR-196a高表达27例;各组NPC血清miR-196a表达与正常对照组比较,差异均具有统计学意义(P均<0.01)。按放疗效果分析,86例A组患者,血清miR-196a高表达71例(82.56%);52例B组患者,血清miR-196a高表达51例(98.08%),包括稳定进展19例(100.00%,19/19)和部分缓解32例(96.97%,32/33);A、B两组血清miR-196a高表达比较,差异具有统计学意义(P<0.01)。A组患者中位DFS(36个月)明显高于B组患者中位DFS(10个月),差异具有统计学意义(P<0.01)。结论：血清miR-196a高表达提示临床NPC放疗预后不佳,该基因有望成为NPC预后的血清生物标志物。

　　本文源自中国耳鼻咽喉颅底外科杂志,2020,26(04):405-409.《中国耳鼻咽喉颅底外科》杂志，于1995年经国家新闻出版总署批准正式创刊，CN:43-1241/R，本刊在国内外有广泛的覆盖面，题材新颖，信息量大、时效性强的特点，其中主要栏目有：临床报道、病案报道、综述等。

　　鼻咽癌为我国常见的头颈部恶性肿瘤之一,具有明显区域聚集性,在中国南部地区发病率较高[1]。我国NPC发病率和死亡率均高于全球平均水平[2]。NPC早期症状不明显,且癌灶隐匿于鼻咽腔内,所以临床NPC早期诊断有一定难度[3]。临床NPC最后确诊时,约70%～80%已发生颈部淋巴结转移甚至远处转移[4]。放射治疗是临床NPC首选的治疗方法,放疗能有效控制NPC病变。随着调强放疗的推进,NPC疗效显著,但放疗后仍有30%出现远处转移和/或复发[5]。另一方面,NPC放疗有较大的毒副反应。因此,放疗疗效是NPC研究的一个重要方向。

　　MicroRNAs(miRNAs)是一种短的(20～24nt)单链小分子RNA,在多种肿瘤中表达异常,而患者液体活检的血清miRNAs是一种潜在的生物标志物[6]。目前miRNAs在肿瘤诊治方面已取得了较大进展,血清miRNAs可以应用实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)进行分析。在qPCR中,目标核酸的起始拷贝数越高,则荧光增加越快。本研究应用相对定量qPCR的比较CT法评估基因表达水平。

　　MicroRNA-196a(miR-196a)是由两个基因组位点HOXC(人类的Chr12,基因MIR196A2)和HOXB(人类的Chr17,基因MIR196A1)转录而来,分别位于HOX9的上游[7]。MiR-196a与癌症发生发展密切相关,发挥一种致癌基因的作用。本研究旨在探讨miR-196a在NPC中表达的临床意义,分析人NPC血清miR-196a的表达差异以及与NPC放疗反应的相关性。

　　1、资料与方法

　　1.1临床资料

　　收集中南大学湘雅医院2010年6月—2019年6月接受调强放疗(68.0～73.6Gy)NPC患者临床资料,分析随访结果选取138例NPC患者作为研究的实验组,包括男86例,女52例;年龄35～73岁,中位发病年龄为49岁。根据AJCC(第八版)NPC临床分期:Ⅰ期16例,Ⅱ期36例,Ⅲ～Ⅳ期86例。138例均为非角化癌(未分化型)。另以来院健康体检结果均正常者62例作为对照组,男37例,女25例;年龄38～71岁,中位年龄47岁。本研究经患者及本院伦理委员会同意。

　　1.2治疗方法及血液收集

　　本研究入选的NPC临床资料和随访结果齐全,138例均为单纯接受调强放疗(68.0～73.6Gy/30～33次,2.1～2.3Gy/次)的NPC患者。对照组62例采集空腹静脉血;实验组138例NPC患者均在放疗前采集空腹静脉血;采集后的静脉血首先置于4℃,静置2h;然后低温离心机4℃低速离心10min(2000g)取上清液;所有血清均离心取上清后保存于-80℃备用。

　　1.3血清总RNA提取

　　首先分取400μL血清,加600μL的Trizol,混匀后再静置10min;再加200μL的氯仿,振荡15s后静置15min;低温离心机4℃下12000转离心25min后取上清;然后异丙醇与上清液以等体积轻轻混匀,并室温静置10min,4℃下12000转离心15min,弃上清留沉淀;加1mL无酶水配制的75%乙醇,轻轻混合再4℃离心5min(7000转)弃上清留沉淀晾干,加入25μL无酶水溶解沉淀;以无酶水作空白对照测RNA浓度。

　　1.4总RNA逆转录

　　在冰上溶解提取的RNA,用逆转录酶把提取的RNA逆转录成cDNA:反应管分别加入1μg小分子RNA、PolyAPolymerase(2.5U/μL)1μL、1μL的RTaseMix、5μL的5×PAP/RTBuffer,用ddH2O(RNase/Dnasefree)补充至25μL,在37℃作用60min、85℃下5min灭活酶,即获得逆转录产物。

　　1.5qPCR分析血清miR-196a表达

　　实验在冰上进行:用双蒸水稀释miR-196a引物及随机下游引物稀释成2μΜ(U6的引物序列:CAAGGATGACACGCAAATTCG;hsa-miR-196a的引物序列TAGGTAGTTTCATGTTGTTGGG),设置U6为内参基因,通用反向引物(Universalprimer)QIAGEN试剂盒自带,引物试剂盒均由锐博公司提供;用双蒸水将上述逆转模板cDNA按1:3稀释。在EP管中混合下列试剂:10μL的2×All-in-OneqPCRMix、2μL的All-in-OneTMmiRNAqPCRPrimer(2μM)、2μL的UniversalAdaptorPCRPrimer(2μM)、1:3稀释模板cDNA、0.4μL的50×ROXReferenceDye,用3.6μL双蒸水补充至20μL;短暂离心,加入96孔qPCR板内离心:按表1设置qPCR反应程序完成miR-196a的qPCR分析。

　　表1血清miR-196aqPCR反应程序设置

　　1.6统计学方法

　　基因表达量的计算,采用2-CT法,计算出cutoff值。所有数据应用SPSS10.0统计软件统计,以%表示所有计数资料,以χ2检验分析数据;以(x±s)表示计量资料以t检验分析数据,以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2、结果

　　2.1NPC患者血清miR-196a的表达

　　本研究应用相对定量qPCR的比较CT法评估基因表达水平,以比较CT法评估miR-196a基因表达高低,直接从qPCR仪器获取相对定量数据。qPCR显示NPC患者血清miR-196a以高表达为主,而正常血清miR-196a以低表达为主。当cutoff值为0.0813时:138例NPC患者血清miR-196a高表达122例(88.41%);而对照组62例血清中,仅6例miR-196a高表达(9.68%);两组miR-196a高表达相比较,差异均具有统计学意义(P均<0.01);而两组的性别、年龄相比较,差异均无统计学意义(P均>0.01)。

　　2.2患者血清miR-196a高表达与NPC临床分期的关系

　　138例NPC患者miR-196a在血清中高表达122例(88.41%);其中86例临床分期Ⅲ、Ⅳ期NPC患者血清miR-196a高表达81例,16例临床分期Ⅰ期NPC患者血清miR-196a高表达14例,36例临床分期Ⅱ期NPC患者血清miR-196a高表达27例;NPC患者各组血清miR-196a表达与正常对照组比较,差异均具有统计学意义(P均<0.01)。具体见表2、3。

　　表2NPC组各临床分期与对照组的血清miR-196a表达情况比较(例)

　　2.3患者血清miR-196a高表达与NPC放疗效果的关系

　　采用如上述qPCR的2-△△CT法标准分析NPC血清miR-196a表达,当cutoff值为0.0813时,高于该值为miR-196a高表达。本研究qPCR显示放疗后癌灶稳定进展的NPC患者(19例)所有血清均高表达miR-196a,因此我们按放疗效果进行了miR-196a的表达分析。临床上NPC放疗后癌灶完全缓解(A组),提示放疗效果相对较好;NPC放疗后癌灶稳定进展患者,临床提示其放疗效果相对较差(B组);NPC放疗后癌灶部分缓解患者,提示其疗效介于两者之间,但放疗后癌灶部分缓解可能有癌细胞残存,所以这些NPC归于B组。MRI显示A组完全缓解NPC患者肿块对放疗敏感,患者放疗前后肿块变化显著(图1a、b),而B组放疗稳定进展NPC患者MRI显示整块继续增大(图1c、d);另一方面,血清样本qPCR的溶解曲线为一个单一的吸收峰(图2a)且扩增曲线较好(图2b),提示该基因血清中稳定易于检测;miR-196a高表达提前进入指数扩增期、如箭头所指上升曲线居前(图2b)。

　　根据NPC放疗效果分析血清miR-196a高表达结果:A组完全缓解NPC的86例,71例患者血清miR-196a高表达(71/86,82.56%);B组19例稳定进展NPC患者均为miR-196a高表达(19/19,100.00%),以及B组33例部分缓解NPC患者高表达32例(32/33,96.97%),B组高表达共为51例(51/52,98.08%);两组相比差异具有统计学意义(χ2=7.614,P<0.01)。完全缓解NPC患者中位DFS(36个月)明显高于放疗稳定进展NPC患者中位DFS(10个月)(P<0.01)。

　　表3NPC组各临床分期的血清miR-196a表达情况比较[例(%)]

　　图1影像学MRI检测NPC患者放疗前后肿块变化,A组患者放疗前NPC(a)红色线圈内所示NPC肿块(Ⅳ),放疗12个月后复查(b)NPC肿块完全缓解;B组患者放疗前NPC(c)红色线圈内所示为NPC肿块,放疗12个月后复查(d)红色线圈内NPC继续增大肿块

　　图2NPC血清一组样本qPCR分析miR-196a表达的代表性结果

　　3、讨论

　　非编码微小RNA(microRNAs,miRNAs)是内源性的RNA分子,具有抑癌基因或癌基因的双重作用,为18～25个核苷酸组成单链的RNAs,在调控细胞增殖、分化和凋亡等方面发挥重要作用[8]。非编码miRNA可以靶向特定的编码mRNA形成相对完整的互补结构,可导致靶向的mRNA被降解而负调控蛋白质翻译过程[8,9,10]。不同种类的肿瘤具有不同的miRNAs表达谱,miRNAs表达谱与肿瘤特性相关。检测miRNAs表达水平,可用于肿瘤疗效评估和预后判断,可作为肿瘤诊断的标志物[8,9,10]。

　　有研究显示miR-196a在多种肿瘤中有癌基因的特性,在肿瘤发生发展中起重要作用。MiR-196被报道在各种恶性肿瘤中异常表达,包括黑素瘤[9]和食管癌[10]。研究者认为是消化道肿瘤的生物标志物[11]。本研究显示miR-196a在正常人血清中低表达,而在NPC血清中高表达,与文献报道的结果一致。研究也表明低氧诱导的miR-196下调可促进肝癌发生及促进肝癌转移[12];miR-196a通过靶向IκBα促进转移的结直肠癌[13]。我们进一步分析发现血清miR-196a高表达与NPC临床分期相关,晚期NPC患者血清miR-196a高表达(94.19%)。这些结果提示miR-196a在NPC中同样有癌基因特性,进一步验证miR-196a的恶性特征。

　　目前血清miR-196a表达是否能影响NPC放疗反应尚未见报道。Bao等[14]研究显示血清miR-196a为非小细胞肺癌的无创检测生物标志物。本研究分析显示miR-196a高表达与放疗效果有关,qPCR显示放疗后癌灶稳定进展的NPC患者所有血清均高表达miR-196a,而MRI显示放疗稳定进展NPC患者整块继续增大(从图1c放疗前,变成图1d放疗后);而血清miR-196a分析显示放疗稳定进展NPC患者该基因高表达(图2b),因此提示NPC患者血清中miR-196a高表达,可能影响NPC放疗效果,放疗前血清miR-196a高表达是NPC患者放疗的不利因素,但血清miR-196a参与NPC放疗反应调控的机制尚不清楚,而且其调控的靶基因亦待深入研究。

　　在本研究中,我们对NPC血清中miR-196a表达进行了初步分析,初步结果提示miR-196a高表达可能是NPC无创检测的一个血清特征分子,放疗前NPC患者血清miR-196a高表达为NPC放疗不利因素,提示NPC血清中miR-196a高表达者可能预后不佳。