HLA-Ⅱ类基因与狼疮性器官系统损害

　　摘　要　目的　分析HLA-Ⅱ类基因与狼疮性器官、系统损害的相关性，探讨系统性红斑狼疮(SLE)从基因到临床表达的发病机制。方法　应用PCR-SSOPH技术检测113例确诊SLE病人的DR、DQA1、DQB1等位基因。结果　浆膜炎与DQB1*0601正相关;神经精神症状与DRB1*1501正相关;血肌酐增高与DQB1*0302、DQB1*0401正相关;血尿素氮增高与DQB1*0201负相关;蛋白尿与DQB1*0301、DRB3*0202、DRB3*0301、DRB1*1101负相关;血尿与DQB1*0301、DRB3*0301负相关;管型尿与DRB1*0302正相关;贫血和白细胞减少分别与DQB10201正相关;血小板减少与DRB1*1502和DRB1*1202正相关;淋巴细胞减少与DRB1*0302正相关;C3降低与DQB1*0303正相关，与DQB1*0301负相关;狼疮细胞阳性与DRB1*1501负相关。结论　多个HLA-Ⅱ类等位基因和SLE的临床表达有相关性，国人的SLE遗传背景与其他人种有所不同。

　　关键词：红斑狼疮，系统性;HLA抗原;多态现象(遗传学);易感性与特异性;等位基因

　　系统性红斑狼疮(SLE)发病与多种HLA等位基因相关。为深入探讨这些基因或其关联的亚型与SLE临床表达关系，我们引入PCR-SSOPH检测技术，对113例确诊的SLE病人进行HLA-DR、DQ位点等位基因分型，分析基因与狼疮性器官、系统损害的相关性，找出重型SLE相关基因。

　　1　资料与方法

　　1.1　病例选择：入选的113例患者均符合1982年美国风湿病协会(ARA)SLE诊断标准4条或4条以上[1]。记录患者的性别、发病年龄，以及有无以下SLE临床表现：蝶型红斑、盘状损害、光敏、口腔溃疡、关节炎、雷诺现象、狼疮发、神经精神症状、浆膜炎、血细胞减少、狼疮肾炎和C3降低(<0.8 g/L)等。

　　标本：外周静脉血5 ml(抗凝)。

　　1.2　实验方法：①基因组DNA的提取：盐析法。②DNA体外扩增—聚合酶链反应(PCR)。共有6对引物，其中AMP-B为DR位点扩增的公用引物。③地高辛(DIG)—ddUTP3′末端标记寡核苷酸探针杂交。

　　1.3　分型标准：以显著影响生存率的恶性指标作为重型SLE分型标准[2]。

　　1.4　统计学处理：χ2相关分析、多因素回归分析和多项比较校正，以P<0.05为具统计学显著性。

　　2　结　　　果

　　2.1　HLA-Ⅱ类基因分型

　　2.1.1　等位基因分型结果：用12个DQA1探针检出7个亚型，未检出DQA1*0401;用15个DQB1探针检出12个等位基因，未检出DQB1*0504、*0603和*0604;用4个DR2探针检出4个亚型：用4个DR52组探针检出3个亚型，未检出DRB3*0201;用8个DR52相关组探针分出8个亚型。

　　2.1.2　H-W吻合度检测结果：在HLA-DQA1和DQB1座位上，基因型的期望值与观察值很好吻合，分别P>0.1和P>0.5，说明基因已达到遗传平衡，本组病人可作为可靠的供研究的群体资料。

　　2.2　HLA-Ⅱ类等位基因与SLE器官、系统损害的相关性(见表1)

　　2.2.1　HLA-DQA1位点等位基因：DQA1*0101与淋巴细胞减少正相关;DQA1*0102与狼疮细胞阳性负相关;DQA1*0501与蛋白尿负相关，Pc(多项比较校正P值)>0.05。

　　2.2.2　HLA-DQB1位点等位基因：HLA-DQB1*0201与贫血和白细胞减少正相关，与血尿素氮增高负相关;DQB1*0302与血肌酐增高正相关;DQB1*0303与C3降低正相关;DQB1*0401与血肌酐增高正相关;DQB1*0602与发病年龄正相关，均分别P<0.05，Pc>0.05。

　　DQB1*0301分别与蛋白尿和血尿负相关，分别P<0.001和0.01，分别Pc<0.05和Pc>0.05;与C3降低负相关，分别P<0.05和Pc>0.05。DQB1*0601与浆膜炎正相关，分别P<0.01，Pc<0.05。

　　2.2.3　HLA-DR2组等位基因：DRB1*1501与神经精神症状正相关，与狼疮细胞阳性负相关;DRB1*1502与血小板减少正相关，均分别P<0.05，Pc>0.05。

　　2.2.4　HLA-DR52组等位基因：DRB3*0202与蛋白尿负相关;DRB30301与蛋白尿和血尿均呈负相关，均分别P<0.05，Pc>0.05。

　　2.2.5　HLA-DR52相关组等位基因：DRB10302与淋巴细胞减少和管型尿正相关;DRB1*1101与蛋白尿负相关;DRB1*1202与血小板减少正相关，均P<0.05，Pc>0.05。

　　表1　HLA-DR和DQ等位基因与SLE临床指标的相关性

　　等位基因 临床指标 N1/N2 N3/N4 χ2值 P值 Pc值

　　DQA1*0101 淋巴细胞减少 10/64 16/49 　4.45 0.03+ >0.05

　　DQA1*0102 狼疮细胞阳性 15/25 　2/11 　8.04 0.013- >0.05

　　DQA1*0501 蛋白尿 19/69 　5/44 　4.20 0.04- >0.05

　　DQB1*0201 贫血 　　5/51 18/62 　6.38 0.01+ >0.05

　　白细胞减少 　　8/65 15/48 　6.11 0.01+ >0.05

　　尿素氮增高 16/51 　1/11 　7.00 0.03- >0.05

　　DQB1*0301 蛋白尿 27/69 　3/44 14.39 0.000 1- <0.01

　　血尿 29/90 　1/23 　7.30 0.007- >0.05

　　C3降低 20/51 　9/55 　7.66 0.02- >0.05

　　DQB1*0302 血肌酐增高 　7/55 4/7 　8.84 0.01+ >0.05

　　DQB1*0303 C3降低 10/51 17/55 　8.50 0.01+ >0.05

　　DQB1*0401 血肌酐增高 　1/55 2/7 　8.81 0.01+ >0.05

　　DQB1*0601 浆膜炎 21/99 　8/14 　8.30 0.03+ <0.05

　　DRB1*1501 CNS损害 19/99 　5/13 　6.03 0.049+ >0.05

　　狼疮细胞阳性 11/25 　0/11 10.96 0.01- >0.05

　　DRB1*1502 血小板减少 　0/55 　6/58 　6.01 0.01+ >0.05

　　DRB3*0202 蛋白尿 19/69 　3/44 　7.36 0.007- >0.05

　　DRB3*0301 蛋白尿 12/69 　2/44 　4.08 0.04- >0.05

　　血尿 14/90 　0/23 　4.08 0.04- >0.05

　　DRB1*0302 淋巴细胞减少 　1/64 　5/49 　4.12 0.04+ >0.05

　　管型尿 　4/104 2/9 　5.56 0.02+ >0.05

　　DRB1*1101 蛋白尿 11/69 　1/44 　5.29 0.02- >0.05

　　DRB1*1202 血小板减少 　0/55 　5/58 　4.96 0.03+ >0.05

　　注：N1：等位基因阳性+临床指标阴性数，N2：临床指标阴性数，N3：等位基因阳性+临床指标阳性数，N4：临床指标阳性数，-：负相关，+：正相关

　　此外，本研究尚发现HLA-Ⅱ类基因与多种自身抗体显著关联，但与性别、蝶型红斑、盘状损害、光敏、口腔溃疡、关节炎、雷诺现象和狼疮发无显著相关。

　　2.2.6　多因素回归分析：结果表明等位基因相互间存在复杂的交互关系，DQB1*0401和DQB1*0605分别与血肌酐增高和蛋白尿正相关，分别P<0.05。

　　3　讨　　　论

　　为探讨基因与SLE临床表达关系，找出重型SLE相关基因，我们进一步分析了HLA-Ⅱ类基因与狼疮性器官、系统损害的相关性。

　　3.1　肾脏损害：Fronek等[3]报道DR2与狼疮肾炎相关，还发现稀有等位基因DQB1*0605、*0502与白人、黑人和亚洲人狼疮肾炎显著相关，此相关在亚洲人最显著。Doherty等[4]报道了对南方中国人SLE的研究结果：与健康对照组比，DRw15和DQw1在狼疮肾炎组频率显著增高：与非狼疮肾炎组比，频率无明显增高;王敏等[5]报道，DR2和DR9同时阳性可致狼疮肾炎风险性明显增高;彭学标等[6]的研究结果也表明DR2阳性与江苏地区汉族人SLE肾损害相关;但未见分析DR2亚型相关性的报道。我们的研究结果提示DQB1*0401和DQB1*0302均与血肌酐增高相关;其中DQB1*0401经多因素回归分析保持显著意义，因此是较为肯定的重型SLE相关基因;此外，单因素分析结果未显示DQB1*0605与肾损害相关，但多因素回归分析结果显示其与蛋白尿关联;由于DQB1*0605是稀有基因，显然不能用它解释SLE患者如此高的肾炎发生率;推测DQB1*0605与其他更重要的关联基因一起介导狼疮性蛋白尿的发生与发展。我们的研究未发现单位点DR2等位基因与肾损害关联，它们是否通过与其他基因的组合而致肾炎易感，有待进一步研究。

　　本资料还显示DQB1*0303与C3降低正相关。C3在自身免疫反应过程中起关键性作用，对肾炎的发生与发展尤为重要，早期C3降低是独立影响SLE病人预后的恶性因素[2]。因此DQB1*0303是个重要的SLE相关基因，值得进一步探讨它对SLE的标记性。

　　本研究发现某些等位基因对狼疮肾炎具有保护性，包括DQB1*0201和*0301，分别与血尿素氮和蛋白尿负相关;其中DQB1*0301还与恶性指标C3降低负相关;文献[7]报道DQB1*0301与SLE易感相关，但它可能是中国南方汉族人轻型SLE相关基因。

　　此外，DRB3*0202(DRw52b)、*0301(DRw52c)也与蛋白尿负相关。这与Reveille等[8]报道的美国黑人DRw52b与狼疮肾炎高风险关联相反。这种差异显然与人种的遗传背景有关。我们推测DR52组等位基因单独不能决定狼疮肾炎，但它们与重要的狼疮肾炎相关基因呈连锁不平衡，通过组合而呈现不同的功能：与致肾炎基因连锁，功能显示致病性;与保护性基因连锁，显示保护性。

　　孟炜等[9]报道DQA1*0501是SLE的保护基因，本资料也提示DQA1*0501与狼疮肾炎低风险相关。这与国外报道DQA1*0501为SLE易感基因不一致。

　　我们先前生存率的研究结果显示男性是独立影响SLE病人预后的恶性因素，男性比女性更多出现管型尿[2]。但本研究未发现HLA-Ⅱ类基因在男女性之间的分布有差异。在鼠狼疮，Yaa基因(Y染色体自身免疫反应促进基因)可显著加速狼疮易感鼠发病[10]，且狼疮肾炎严重;在人狼疮，是否存在具有类似功能的基因，值得深入探讨。

　　3.2　中枢神经系统损害：本研究发现DRB1*1501与SLE患者的神经精神症状正相关，这在国内外未见有报道。Reveille等[8]的研究结果提示3.7 kb I DQαRFLP片断与黑人SLE的神经精神症状负相关，并推测具有保护功能的序列在DQα分子链上。本研究结果未能支持这一论点。

　　3.3　血液系统损害：DQA1*0101与淋巴细胞减少相关，未见其他可比性资料供讨论。DQB1*0201与贫血和白细胞减少关联。值得注意的是DQB1*0201同时与血尿素氮增高呈强负性关联，表明该基因主要引起血液系统损害。临床上某些SLE病人以血液系统受累为主要表现，如严重贫血、血小板减少等，而其他系统损害轻或无，可能与携带DQB1*0201基因型有关。

　　3.4　浆膜炎：本研究结果显示DQB1*0601与浆膜炎正相关，是重型SLE相关基因。文献[1]报道DQB1*0601是SLE易感基因。

　　本文研究分析HLA-Ⅱ类基因与狼疮性器官、系统损害的相关性，发现DR和DQ位点均有多个等位基因与SLE临床指标关联，部分显示易感性，部分显示保护性。结果对区分SLE临床亚型，早期预测SLE发展趋势具有一定的参考意义。研究结果表明，重型SLE相关基因主要为DQA1*0101、DQB1*0201、DQB1*0302、DQB1*0303、DQB1*0401、DQB1*0601和DRB1*1501，对SLE具有保护性作用的基因包括DQA1*0501、DQB1*0301、DRB3*0202和DRB3*0301等。

　　谢尚葵现为美国德克萨斯大学西南医学中心风湿病科博士后

　　作者单位：谢尚葵(200040 上海医科大学华山医院皮肤科)

　　冯树芳(200040 上海医科大学华山医院皮肤科)

　　沈福民(上海医科大学公共卫生学院遗传流行病学教研室)

　　参考文献

　　1.Tan EM,Cohen AS,Fries JF,et al.The 1982 revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus.Arthritis Rheum,1982,25:1271-1277.

　　2.谢尚葵，冯树芳，傅华.系统性红斑狼疮病人生存率的研究.中华医学杂志，1995，75：617-620.

　　3.Fronek Z,Timmerman L,Alper C,et al.Major histocompatibility complex genes and susceptibility to systemic lupus erythematosus.Arthritis Rheum,1990,33:1542-1553.

　　4.Doherty DG,Ireland R,Demaine AG,et al.Major histocompatibility complex genes and susceptibility to systemic lupus erythematosus in Southern Chinese.Arthritis Rheum,1992,35:641-645.

　　5.王敏，董怡，黄尚志，等.中国汉人HLA-DRB1及TNF-α基因多态性与SLE遗传易感性的研究.见：中华医学会风湿病学学会.中华医学会第五次全国风湿病学学术会议论文集.北京：中华医学会风湿病学学会，1996.46-52.

　　6.彭学标，徐文严，岳晓玉，等.江苏籍汉族系统性红斑狼疮与HLA-DR基因的相关性研究.中华皮肤科杂志，1997，30：7-9.

　　7.Arnett FC,Olsen ML,Anderson KL,et al.Molecular analysis of major histocompatibility complex alleles associated with the lupus anticoagulant.J Clin Invest,1991,87:1490-1495.

　　8.Reveille JD,Schrohenloher R,Acton RT,et al.DNA analysis of HLA-DR and DQ genes in American black with systemic lupus erythematosus.Arthritis Rheum,1989,32:1243-1251.

　　9.孟炜，沈福民，秦万章，等.中国南方汉族人群HLA-DQA1基因与系统性红斑狼疮易感性分析.中华医学遗传杂志，1994，11：325-328.

　　10.Izui S,Iwamoto M,Fossatl L,et al.The Yaa gene model of systemic lupus erythematosus.J Immunol,1995,144:137-153.

　　11.张咸宁，潘新华，朱定良，等.中国南方汉族人群HLA-DQB1基因对系统性红斑狼疮的易感性研究.中国免疫学杂志，1997，1：37-39.