云南主栽蓝莓果实花色苷组成差异分析

　　摘 要：本研究以云南澄江蓝莓主产区 6 个品种蓝莓鲜果为对象，利用高效液相色谱法(HPLC)和加标定性测定法检测花色苷组成，通过主成分分析法对花色苷组成进行差异分析。结果表明，6 个品种的蓝莓果实中共检测到 10 种花色苷，其中，“比洛克西”的总花色苷含量最高，为 2933.551 mg/kg，芍药素-3-O-葡萄糖苷在“灿烂”中的含量最高，为 204.42 mg/kg;飞燕草素-3-O-半乳糖苷在 “比洛克西”中最高，为 595.614 mg/kg;主成分分析表明不同品种蓝莓单体花色苷所占比例有明显差异，花色苷可以作为化学指纹区分 6 个不同品种的蓝莓，为筛选和培育优质蓝莓品种提供理论支撑。

　　张瑜瑜; 用成健; 刘佳妮; 陈泽斌; 姚丽媛; 华金珠， 东北农业科学 发表时间：2021-08-30

　　关键词：蓝莓;花色苷;高效液相色谱;主成分分析

　　蓝莓(Ericaceae Vaccinium spp.)又名蓝浆果、越桔等，属杜鹃花科(Ericaceae)越桔属(Vaccinium. spp.)植物,为多年生落叶或常绿或小灌木[1]。世界范围内约有 480 余种，是世界上 4 种(草莓、树莓、越桔、醋栗)新兴小浆果类果树之一[2]。

　　蓝莓果实中花色苷含量极高，具有抗氧化、清除自由基、抗衰老等对人体健康有益的生物活性[2-8]。花色苷是一种水溶性色素，属于类黄酮物质，广泛存在于植物的根、茎、叶、花和果实中[4]，同时，由于羟基和甲氧基取代基团的位置和数量不同，各类花色苷会呈现不同的颜色[5]，这也对蓝莓的颜色起到非常重要的作用。

　　不同品种、产地、生长年份、采收期会使蓝莓的花色苷种类和含量产生较大差异[3]。目前，大量研究主要集中在对蓝莓花色苷的提取或纯化[4-6]，有关蓝莓中的花色苷等多酚类物质的活性和功能的研究报道也不少[3-6]，蓝莓果实总花色苷含量因品种、基因型、种植环境和气候条件的不同而差异较大。本研究以云南澄江主栽的 6 个品种蓝莓鲜果为材料，利用高效液相色谱法(HPLC)和加标定性测定法检测各品种成熟鲜果的花色苷组成，通过主成分分析法对 6 个品种的花色苷组成进行差异分析，以期为筛选和培育优质蓝莓品种提供理论支撑。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　云南澄江主产的 6 个蓝莓品种：夏普兰、灿烂、密斯提、比洛克西、绿宝石、莱格西，鲜果成熟后进行采样，每个品种重复 3 次，每次重复随机采样 100 粒，样品采集后放入冰盒带回实验室冷冻保存待用。

　　1.2 试剂

　　飞燕草素葡萄糖苷标准品、矢车菊素葡萄糖苷标准品、矮牵牛素葡萄糖苷标准品、锦葵-3-Q-葡萄糖苷标准品、芍药素葡萄糖苷标准品(购于上海甄准生物科技有限公司)等。

　　1.3 仪器与设备

　　PL204 型精密电子天平;LC-20AB 型高效液相色谱仪;Uv-120-02 紫外分光光度计;BluePard Cu420 电热恒温水浴锅;Lab Tech EV311 旋转蒸发仪;循环水式真空泵;Sigma1-14 离心机;

　　1.4 供试样品花色苷提取

　　参照杨晓慧等[7]的方法稍加改进。取适量蓝莓加入少量去离子水，用匀浆机匀至泥状，精确称取匀浆 0.5 g，用 5 mL 含 5%甲酸的甲醇溶液超声提取 15 min，再于 10 ℃、12000 r/min 的条件下离心 20 min，合并两次上清液，定容至 10 mL，经微孔滤膜(0.45 μm)过滤后进行液相检测。

　　1.5 花色苷定性定量分析

　　参照杨晓慧等[7]花色苷定量方法，采用 HPLC 法测定蓝莓鲜果中的花色苷的种类和相对含量，根据色谱峰保留时间，确定蓝莓果实中的花色苷种类的数量;再分别以飞燕草素葡萄糖苷、矢车菊素葡萄糖苷、矮牵牛素葡萄糖苷、锦葵-3-O葡萄糖苷、芍药素葡萄糖苷为外标物做标准曲线，对蓝莓鲜果的花色苷进行定性和定量分析。

　　1.6 数据分析

　　采用 SPSS20.0 软件进行差异显著性分析和主成分分析。

　　2 结果与分析

　　2.1 不同品种蓝莓果实花色苷含量

　　“比洛克西”蓝莓品种果实总花色苷含量最高，为 2933.551 mg/kg，“莱格西”蓝莓品种果实总花色苷含量次之，为 934.451 mg/kg，属于富含花色苷的品种;“灿烂”、“密斯提”、“绿宝石”等 3 个蓝莓品种果实总花色苷含量居中，为 475.761~684.732 mg/kg，“夏普蓝”蓝莓品种果实总花色苷含量最低，为 110.425 mg/kg;总花色苷含量较高的“比洛克西” 和“莱格西”是总花色苷含量最低的 “夏普蓝”的 8.46~26.56 倍，见表 1。

　　芍药素-3-O-葡萄糖苷是在“夏普蓝”、“灿烂”和“密斯提”中含量最高的花色苷，其中以“灿烂”的含量最高，为 204.42 mg/kg,是”夏普蓝“的 7.84倍，是“密斯提”的 1.34 倍;

　　飞燕草素-3-O-半乳糖苷在“比洛克西”中最高，为 554.408 mg/kg，是“夏普蓝“的 113.65 倍;芍药素-3-O-阿拉伯糖苷在”绿宝石“和”莱格西“中最高，是”夏普蓝“的 16.64~50.45 倍;

　　2.2 不同品种蓝莓花色苷组成比例

　　6 个品种蓝莓果实花色苷组成比例图中，“夏普蓝”、“灿烂”、“密斯提”中的芍药素-3-O-葡萄糖苷相对含量最高，占 20.76%~23.62%，在 6 个品种中变幅范围也最大，为 10.61%~29.85%;在“比洛克西”和“莱格西”中，芍药素-3-O阿拉伯糖苷的组成比例最大，分别为 19.80%和 26.34%，其含量是飞燕草素葡萄糖苷的 293 倍和 25.2 倍;飞燕草素葡萄糖苷的相对含量最低，为 0.06%~1.13%;所有品种的飞燕草素-3-O-半乳糖苷的相对含量都高于 10%; “莱格西”中芍药素-3-O-阿拉伯糖苷的相对含量最高，为 26.34%，除“夏普蓝”外，其余品种的芍药素-3-O-阿拉伯糖苷的相对含量均高于 16%;“绿宝石”的飞燕草素葡萄糖苷相对含量所占比例为 3.45%，“夏普蓝”和“莱格西”的飞燕草素葡萄糖苷相对含量所占比例分别为 1.13%和 1.05%，其余 3 个品种均低于 1%，见图 1。

　　2.3 不同品种蓝莓花色苷主成分分析

　　为了更好地分析 6 个不同品种的蓝莓花色苷的组成，以花色苷相对含量进行主成分分析(图 2)。由主成分分析散点图(图 2-A)可以看出，主成分 1(PC1)解释了总方差的 84.246%，主成分 2 解释了总方差的 14.000%，它们共同解释了总方差的 98.246%，能够很好的解释变量的总体变化情况。由图 2 可知，主成分 1 把 6 个品种分成 2 大类，一类为“夏普蓝”，另一类为“灿烂”、“密斯提”、 “比洛克西”、“绿宝石”、“莱格西”等 5 个品种。主成分 2 又进一步将这 6 个品种分在 3 个象限，其中，“灿烂”、“密斯提”、“比洛克西”、“绿宝石”4 个品种分在第 1 象限，“夏普蓝”在第 2 象限，“莱格西”位于第 4 象限，“莱格西”紧邻着主成分 2 的负坐标轴。由此可以说明，主成分 1 和主成分 2 能将这 6 个品种明显地区分开。

　　主成分分析的散点图(图 2-A)和载荷图(图 2-B)共同反映了蓝莓品种与各类花色苷的对应关系，由图 2-B 可知，除了芍药素-3-O-葡萄糖苷外，其余的花色苷都在 X 轴的正半轴，结合图 2-A 可以说明，“比洛克西”中，飞燕草素-3-O半乳糖苷的贡献是最大的;飞燕草素葡萄糖苷位于载荷图第二象限，因此在主成分分析图中可以区分出“夏普蓝”这个品种。

　　3 讨论

　　3.1 不同品种蓝莓果实花色苷组成及含量分析

　　本研究针对花色苷类化合物具有特征吸收峰的特点，采用 HPLC 标准品外标法直接对蓝莓果实花色苷的粗提物进行测定，对其组成及含量进行探讨。

　　研究结果显示，蓝莓花色苷的组成及所占比例主要受蓝莓的品种特征影响，但不同品种蓝莓的花色苷组成和相对含量主要由遗传因素决定[8-10]。本试验研究表明，在 6 个品种的蓝莓成熟果实中共检测到 10 种不同结构的花色苷，说明所研究的 6 个品种的蓝莓果实均含有非常丰富的花色苷;且芍药素-3-O-葡萄糖苷的含量最高，为 26.078~476.703 mg/kg，因此，可以用作分离制备该花色苷的原料，本试验研究结果表明，芍药素-3-O-葡萄糖苷在各品种间均是含量最高的组分，这与谢国芳[12]的检测结果一致，但不同品种间其含量仍有较大差异(16.25%~23.62%)。

　　同时，同一种花色苷在不同品种间存在显著差异，各种不同的花色苷在特定品种的组成是相对稳定的，这与朱金艳[11]的研究结果大致相似的;花色苷相对含量的高低还受栽培地的生态环境、土壤质地的影响 [12]。

　　3.2 不同品种蓝莓果实的花色苷构成及含量影响因子

　　花色苷合成酶的催化活性在一定程度上受日照条件的影响，紫外线照射可以明显提高花色苷合成酶的催化活性[13]，因此也就间接影响花色苷含量及构成比之间的差异。大量研究表明，植物花色苷的生成水平明显受到光照等外界环境因子的影响。本研究的对象是 6 个品种蓝莓鲜果的花色苷，种植地为云南澄江，该地处于高海拔低纬度地区，平均日照时间长，紫外线辐射相对较强，是促进植物合成花色苷的重要因子。由此可知，除品种差异外，日照长短和紫外线强度等因子也是造成花色苷含量差异的原因。

　　4 结 论

　　本研究利用高效液相色谱法(HPLC)和加标定性测定法对 6 个品种蓝莓果实的花色苷组成和相对含量进行探讨，同时，对不同品种蓝莓果实的各类花色苷进行比较研究，并基于单体花色苷相对含量进行主成分分析。试验在 6 个品种的蓝莓果实中共检测到 10 种花色苷，其中，“比洛克西”果实总花色苷含量最高，为 2933.551 mg/kg，“莱格西”次之，为 934.451 mg/kg，属于富含花色苷的品种;芍药素-3-O-葡萄糖苷是所测品种的“夏普蓝”、“灿烂”和“密斯提”中含量最高的花色苷，其中以“灿烂”的含量最高，为 204.42 mg/kg,是”夏普蓝“中芍药素-3-O-葡萄糖苷的 7.84 倍，是“密斯提”的 1.34 倍;飞燕草素-3-O-半乳糖苷的含量在“比洛克西”中最高，是“夏普蓝“中飞燕草素-3-O-半乳糖苷的 113.65 倍;芍药素-3-O-阿拉伯糖苷的含量在”绿宝石“和”莱格西“中最高，是”夏普蓝中“芍药素-3-O-阿拉伯糖苷的 16.64~50.45 倍;“夏普蓝”、“灿烂”、“密斯提”中，芍药素-3-O-葡萄糖苷的相对含量最高，为 20.76%~23.62%，在 6 个品种中波动范围也最大，为 10.61%~29.85%;主成分分析显示不同品种蓝莓单体花色苷所占比例存在明显差异，可知，花色苷可以作为化学指纹来区分 6 个不同品种的蓝莓，以期为筛选和培育优质蓝莓品种提供理论支撑。