去氧紫草素对原代神经元线粒体自噬的影响

　　摘要：目的 基于mt-Keima荧光蛋白研究去氧紫草素对神经元线粒体自噬的影响。 方法 定位于线粒体上的Keima蛋白(mt-Keima)，具有pH敏感性，在中性pH和酸性溶酶体中分别被458 nm和561 nm 激光激发，反映线粒体自噬活性。分离 mt-Keima转基因小鼠的原代皮层神经元，用自噬抑制剂巴弗洛霉素 A1 (100 nmol·L-1 )处理mt-Keima神经元24 h，激光共聚焦显微镜观察mt-Keima蛋白在细胞内的荧光信号并对线粒体自噬变化进行定量分析，从而检测mt-Keima线粒体自噬评价体系的可靠性。502个天然小分子化合物处理mt-Keima神经元，通过高内涵成像分析561 nm和458 nm激光下相对荧光强度;用筛选出的去氧紫草素(100 nmol·L-1 )处理神经元24 h，激光共聚焦观察mt-Keima蛋白的荧光变化并对线粒体自噬变化进行定量分析;免疫荧光检测原代神经元线粒体外膜受体蛋白 Tom20(Mitochondrial import receptor sub⁃ unit Tom20，Tom20)的表达，进一步反映线粒体自噬水平的变化;四甲基若丹明甲酯染料染色后，利用激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位的变化。结果 激光共聚焦显微镜结果显示，神经元细胞表达了mt-Keima 蛋白;与DMSO相比，100 nmol·L-1 巴弗洛霉素A1处理组mt-Keima在561 nm和488 nm 激光下的荧光强度比值下降，表明线粒体自噬水平降低(P<0.01)，此结果说明mt-Keima能够指示线粒体自噬活性;高内涵分析结果和激光共聚焦的验证结果表明，与对照组相比，100 nmol·L-1 去氧紫草素处理组mt-Keima在561 nm 以及 488 nm 激光下的荧光强度比值增强，表明线粒体自噬水平增加(P<0.01);免疫荧光结果表明去氧紫草素处理后Tom20蛋白的表达下调(P<0.01)，诱导了线粒体自噬;激光共聚焦显微镜结果显示在去氧紫草素处理组，神经元细胞线粒体膜电位无变化。结论 去氧紫草素在不造成线粒体损伤的前提下促进神经元的线粒体自噬。

　　本文源自路丁乙; 李婷; 姚铖铖; 陈佳意; 赵洁; 韩秋影; 李爱玲; 潘欣， 中国药理学与毒理学杂志 发表时间：2021-05-09《中国药理学与毒理学》杂志，于1986年经国家新闻出版总署批准正式创刊，CN:11-1155/R，本刊在国内外有广泛的覆盖面，题材新颖，信息量大、时效性强的特点，其中主要栏目有：论著、方法、综述等。

　　关键词：线粒体自噬;mt-Keima;去氧紫草素

　　神经元主要依赖氧化磷酸化来产生能量，因此线粒体健康状态对于神经元功能至关重要[1]。线粒体自噬(mitophagy)是自噬的一种，即通过自噬方式特异性去除受损的线粒体，是维持线粒体质量控制的关键环节。鉴于神经元的特殊功能，神经系统的线粒体自噬水平非常活跃。神经元线粒体自噬与衰老以及神经退行性疾病密切相关，神经元线粒体自噬异常会导致细胞内受损的线粒体累积，进一步诱导活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生，导致线粒体过度破裂，引起细胞损伤，从而加速机体衰老进程[2]。因此，通过药理学方法增加或者恢复线粒体自噬作用，为延缓衰老以及治疗神经退行性疾病开发新的治疗靶点，已成为研究的一大热点[3-4]。

　　为开发潜在的促进线粒体自噬的化合物，本研究从包含 502 个天然小分子化合物库中筛选促进神经元线粒体自噬的小分子，进而筛选到去氧紫草素这一小分子。紫草素是从天然的中草药紫草中提取的活性物质，具有免疫调节、抗炎、抗肿瘤等多种活性[5-7]。目前尚未报道该化合物能够促进神经元的线粒体自噬。本实验通过分离 mt-Keima 转基因小鼠[8](具有全身线粒体定位的 Keima 蛋白)的原代皮层神经元，验证了去氧紫草素能够促进神经元的线粒体自噬，此研究为治疗神经退行性疾病提供了新的方向。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物、试剂和仪器

　　mt-Keima转基因小鼠来自美国杰克森实验室，库存号：028072;;C57BL/6来自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK(京)2016- 0006。神经元基础培养基、胎牛血清、N-2、B27 无血清添加剂、DMEM 高糖培养基都来自美国 Gibco 公司;马血清来自北京中杉金桥生物技术有限公司;青霉素-链霉素双抗、多聚赖氨酸来自中科迈晨北京科技有限公司;胰蛋白酶来自美国 Sigma 公司;Lab-Tek 八腔室、四甲基罗丹明乙酯(Tetra⁃ methylrhodamine，TMRM)来自美国 Thermo Fisher 公司;巴弗洛霉素 A1 来自美国 Selleck 生物科技有限公司;去氧紫草素(纯度 99.36%)来自上海陶素生化科技有限公司;羰基氰化氯苯腙(Carbonyl cy⁃ anide 3 - chlorophenylhydrazone，CCCP)来 自 美国 Sigma公司;线粒体外膜受体蛋白Tom20(Mito⁃ chondrial import receptor subunit Tom20，Tom20)鼠单克隆抗体来自美国 Santa Cruz 公司;羊抗鼠 Alexa Fluor 488和 Hoechst 细 胞核染料来自美国 Thermo Fisher Scientific公司，荧光封片剂(含DAPI)来自北京中杉金桥公司;黑色96孔板来自美国Per⁃ kin Elmer 公司。激光共聚焦荧光显微镜来自德国 Zeiss 公司;倒置相差显微镜来自日本 Nikon 公司;高内涵成像分析仪来自美国Perkin Elmer公司。

　　1.2 神经元的分离及培养

　　实验室繁殖得到的 mt-Keima 转基因小鼠和维通利华公司购得野生型 C57BL/6孕鼠，按照本实验已有的方法分离原代皮层神经元[9]，分离好的神经元种于接种液(含10%的胎牛血清、马血清以及1% 的青霉素-链霉素双抗混合液的DMEM培养基)中，于 37℃，5% CO2的恒温培养箱培养 6 h 后，换为神经元培养基(含 2% 的 B27、1% 的 N-2、谷氨酰胺以及青霉素-链霉素双抗混合液的Neurobasal 基础培养基)继续培养，体外培养6~7 d可进行实验。

　　1.3 检测mt-Keima荧光蛋白在原代神经元细胞中的表达

　　分离得到的 mt-Keima 转基因小鼠的原代神经元按照每孔 2×104 个细胞均匀种在Lab-Tek八腔室中，在体外培养 7 天，置于激光共聚焦显微镜下观察，在波长为 458 和 561 nm 的激发光下检测细胞的发光情况。

　　1.4 检测巴弗洛霉素A1对神经元线粒体自噬的影响

　　分离得到的 mt-Keima 转基因小鼠的原代皮层神经元，在体外分化第6天时，分别用100 nmol·L-1 巴弗洛霉素 A1(实验组)和相同浓度的 DMSO(对照组)处理 24 h 后，将加药后的神经元置于激光共聚焦显微镜下观察，在波长为 458 和 561 nm 的激发光下检测细胞的发光情况，利用 Volocity 软件处理拍摄后的图像，统计每个细胞中 561 nm 荧光信号强度和 458 nm 荧光信号强度，计算比值表示线粒体自噬水平。

　　1.5 高内涵筛选促进神经元线粒体自噬的化合物

　　96 孔板提前 1 h 铺上多聚赖氨酸，之后用高压过的无菌水清洗2次，晾干待用。mt-Keima转基因小鼠的神经元细胞按照 2×10^ 4 个每孔种于 96孔板中。神经元细胞培养第 6 天，每孔加入不同的天然小分子化合物(共 502 个)，处理 24 h 后，将孔板放入高内涵仪中进行扫描。利用高内涵数据分析软件进行分析，计算细胞中 561 nm 荧光信号强度和 458 nm 荧光信号强度，计算比值(线粒体自噬指数)用来表示线粒体自噬水平。

　　1.6 去氧紫草素促进神经元线粒体自噬的检测

　　分离得到的 mt-Keima 转基因小鼠的原代皮层神经元，在体外分化第 6天时，分别用 100 nmol·L-1 巴弗洛霉素 A1(实验组)和相同浓度的 DMSO(对照组)处理 24 h 后，之后将神经元置于激光共聚焦显微镜下观察，在波长为 458 和 561 nm 的激发光下检测细胞的发光情况，利用 Volocity 软件处理拍摄后的图像，统计细胞中 561 nm 荧光信号强度和 458 nm 荧光信号强度，计算比值表示线粒体自噬水平。

　　1.7 神经元线粒体膜电位的测定

　　分离得到的 C57BL/6 野生型小鼠的神经元细胞，在体外分化第6天时，实验组分别用100 nmol·L-1 去氧紫草素处理24 h和10 μmol·L-1 羰基氰化物间氯苯 腙(Carbonyl cyanide 3 - chlorophenylhydrazon， CCCP)处理 12 h，其中 CCCP 为线粒体解偶剂，破坏线粒体膜电位，可作为本实验的阳性对照。处理 24 h的溶剂(DMSO)作为对照组，吸弃八腔室中的神经元培养基，用神经元培养基稀释四甲基若丹明甲酯(Tetramethylrhodamine methyl ester，TMRM)，终浓度为 100 nmol·L-1 ，配置成 TMRM 的染色液，在 37℃孵育 30 min，孵育结束后，吸弃染色液，用 PBS缓冲液洗涤细胞一次，培养液换成新鲜的神经元培养基，Hoechst(1∶1000)溶于 PBS 缓冲液中染核 8 min，之后置于激光共聚焦显微镜下观察扫描。

　　1.8 免疫荧光检测神经元Tom20的表达

　　将 Platinum Line Cover Glass 玻片置于 24 孔板内，加入 300 μL 的多聚赖氨酸置于 37℃培养箱 1 h 后，每孔接种 4×10^ 4个 C57BL/6 野生型小鼠的原代皮层神经元细胞，在体外分化第6天时，分别用 100 nmol·L-1去氧紫草素(实验组)和相同浓度的DMSO(对照组)处理24 h。细胞用4%的多聚甲醛在37℃敷箱固定15 min(多聚甲醛需要提前预热)，用1×PBS清洗1次，之后用含有0.3%的Triton-100 的PBS打孔10 min。用含3%羊血清的PBS(封闭液)室温封闭 1 h 后，一抗 Tom20(1∶400)4℃ 孵育过夜，荧光二抗 Alexa Fluor 488(1∶400)室温孵育 1 h，最后用荧光封片剂(含 DAPI )封片，室温晾干后，置于激光共聚焦显微镜下观察。

　　1.9 统计学分析

　　使用 GraphPad Prism6.0 软件对数据进行统计学分析，实验结果数据以x±s表示，两组间采用双样本 t检验分析，多组间采用单因素方差分析比较， P<0.05 为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 mt-Keima荧光蛋白在原代神经元细胞中表达

　　将分离的 mt-Keima 转基因小鼠的原代皮层神经元体外培养 7 天后，置于共聚焦荧光显微镜下观察，细胞在 458 nm 激发的荧光(标记为绿色)有很好的线粒体定位，形状为丝网状，用于指示中性胞浆中的线粒体;在 561 nm 激发下有明显的点状聚集(标记为红色)，指示进入酸性溶酶体中的线粒体。共聚焦荧光显微镜观测的结果显示，mt-Keima荧光蛋白在原代神经元细胞中表达，且本底具有一定的线粒体自噬水平(图1)。

　　2.2 mt-Keima能够指示线粒体自噬活性

　　为验证 mt-Keima 能够反映线粒体自噬，使用自噬抑制剂巴弗洛霉素 A1 处理原代神经元，在激光共聚焦荧光显微镜下检测 mt-Keima 荧光信号。与DMSO组相比，巴弗洛霉素A1(100 nmol·L-1 )处理后的神经元细胞，mt-Keima蛋白的酸性荧光信号(红色)减弱，线粒体自噬水平(561 nm 荧光信号强度/458 nm 荧光信号强度)下降(P<0.01)。以上结果说明，mt-Keima能够很好的指示线粒体自噬活性(图2)。

　　2.3 去氧紫草素能够促进神经元线粒体自噬水平

　　根据高内涵的筛选结果(图3B)，发现去氧紫草素处理后，线粒体自噬水平(561 nm荧光信号强度/ 458 nm荧光信号强度)明显高于DMSO组，提示去氧紫草素可能能够促进神经元的线粒体自噬。随后对该结果进行验证。将分离得到的 mt-Keima转基因小鼠的神经元细胞，给予 100 nmol·L-1 去氧紫草素处理后，与 DMSO 组相比，神经元细胞中 mtKeima蛋白的酸性荧光信号(红色)增强(图3C)，指示进入溶酶体中的线粒体增多，线粒体自噬水平(561 nm 荧光信号强度/458 nm 荧光信号强度)增加(P<0.01)。以上结果说明，去氧紫草素能够促进神经元的线粒体自噬。

　　2.4 去氧紫草素促进线粒体外膜蛋白Tom20的降解

　　Tom20是线粒体外膜的标志蛋白，在线粒体自噬过程中发生降解。免疫荧光结果表明，与对照组相比，去氧紫草素(100 nmol·L-1 )处理后的神经元细胞Tom20蛋白水平降低(P<0.01)，表明去氧紫草素促进线粒体的降解，线粒体自噬活性增强(图4)。

　　2.5 去氧紫草素不影响神经元线粒体膜电位

　　如图5显示，阳性对照CCCP处理后的神经元，细胞红色荧光信号降低，表明线粒体膜电位下降(P<0.01)。去氧紫草素处理后的细胞与 DMSO 组相比，细胞都呈现较强的红色荧光，表明线粒体膜电位较高。以上结果说明，去氧紫草素不影响神经元的线粒体膜电位。

　　3 讨论

　　线粒体是细胞中的代谢中心和信号枢纽[10]，研究表明，线粒体功能障碍已经成为多种神经退行性疾病的的共同特征[1 1 - 1 3]，因此清除受损的线粒体，维持线粒体的正常功能，对于改善神经退行性疾病有着重要的意义。由于神经元的再生能力低，能量需求高，线粒体自噬活性对神经元的健康状态至关重要[1 4 - 1 5]。Keima具有 pH敏感性，且不易被溶酶体进行降解的特性，目前已被应用于检测自噬。 Katayama 等人将线粒体定位序列与 Keima 进行融合表达[1 0]，将 Keima定位于线粒体，用于指示线粒体自噬。Sun 等人构建了 mt-Keima 转基因小鼠的模型，可以在体内更加生理地分析线粒体自噬过程[8]。本实验分离mt-Keima转基因小鼠的神经元，经巴弗洛霉素A1处理后，神经元线粒体自噬被抑制，证明了mt-Keima可用于指示线粒体自噬活性。

　　靶向线粒体自噬，通过药理学手段提高线粒体自噬水平，为干预衰老以及年龄相关的疾病提供新的途径，也是目前研究的热点[1 6 - 1 8]。天然化合物在自然界中广泛存在，一般毒副作用小。目前报道诱导线粒体自噬的几种天然化合物，如尿石素A、亚精胺或烟酰胺单核苷酸等，可以保护细胞并达到延缓衰老的作用[16，19-20]。然而，已报道的能够促进线粒体自噬的化合物能够在临床中得到广泛应用的还非常少，因此开发新的促进神经元线粒体自噬的化合物，具有重要的科学意义和临床意义。基于 mtKeima 体系筛选出来的天然小分子化合物去氧紫草素能够促进神经元的线粒体自噬水平，并且通过免疫荧光实验得到了进一步的验证。线粒体膜电位是反映细胞内线粒体功能状态的重要参数之一，本研究发现在 100 nmol·L-1 去氧紫草素处理下，并不影响神经元的线粒体膜电位，说明去氧紫草素能够在不造成线粒体损伤的前提下促进神经元的线粒体自噬。由于神经元较为敏感，在高剂量去氧紫草素的处理下，神经元会发生死亡。因此本实验选择了100 nmol·L-1 进行研究，在该剂量处理下，去氧紫草素既不影响神经元细胞的活力状态，又能够最大程度诱导线粒体自噬。

　　已知磷脂酰肌醇-3 激酶(phosphoinositide 3- kinase，PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B，AKT)/ 雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamy⁃ cin，mTOR)途径是细胞自噬的重要通路，目前有研究表明，紫草素可通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导宫颈癌细胞、乳腺癌细胞发生自噬[21-22]，从而起到杀伤肿瘤细胞的作用。因此去氧紫草素促进神经元的线粒体自噬是否也是靶向 PI3K/AKT/ mTOR信号通路，有待进一步的研究和探索。

　　本研究发现，去氧紫草素能够安全有效地促进神经元的线粒体自噬。因此，去氧紫草素在延缓衰老和治疗神经退行性疾病方面可能也有着很重要的应用前景，也为治疗衰老以及年龄相关的疾病提供新的思路。