EuDQD/SDH6基因在巨尾桉莽草酸途径中的功能分析

　　摘 要 莽草酸脱氢酶家族是多酚类物质合成的关键分支酶，本研究体外分离获得巨尾桉 EuDQD/SDH6 基因(KY401152.1)，在大肠杆菌中表达并纯化了 DQD/SDH6 蛋白，以莽草酸为底物的 DQD/SDH6 酶动力学参数为 Km=29.93 mmol/L，Vmax=(149.96±0.003) mmol L-1 s -1，表明该蛋白具有 SDH 活性。实时定量 PCR 技术研究 EuDQD/SDH6 在巨尾桉中的表达特性，发现 EuDQD/SDH6 主要在叶片中表达，其次是茎部，根部最少，随着叶片的成熟 EuDQD/SDH6 的表达量也逐渐减少。综合分析了实时定量 PCR、SDH 酶活性和 HPLC 法测定的酚酸含量的数据，研究巨尾桉 DQD/SDH6 的酶功能。EuDQD/SDH6 的基因表达量与 SA、 PCA 累积量均呈负线性相关，与 GA 累积量正线性相关，但关联性较弱，推测桉树 DQD/SDH6 在巨尾桉中的生物功能可能是以 3 脱氢莽草酸为底物合成没食子酸，为单宁合成提供前体。EuDQD/SDH6 基因的表达量与硫酸木质素的含量呈正相关，推测 EuDQD/SDH6 基因的表达影响木质素在巨尾桉中的累积。

　　本文源自赵艳玲; 王梅， 分子植物育种 发表时间：2021-05-10《分子植物育种》(双月刊)创刊于2003年，由海南省生物工程协会主办。是一份为转基因育种、分子标记辅助育种及常规育种服务的国际化科学期刊，内容涉及了水稻、小麦、玉米、油菜、大豆、棉麻、薯类、果树、蔬菜、花卉、茶叶、林草等多方面，主要是刊登分子遗传育种理论、分子育种方法、分子育种研究动态以及优良种质培育的科学论文报道。

　　关键词 巨尾桉; 莽草酸脱氢酶; 没食子酸; 莽草酸; 原儿茶酸; 木质素

　　微生物和植物中的芳香族氨基酸及大量次级代谢物如鞣酸、单宁等通过莽草酸途径获得必要的前体。莽草酸脱氢酶(简称 SDH)家族分为五类功能酶，具有高度保守的 α/β 折叠三维结构，因活性中心残基和几何结构的轻微不同而具有不同的底物特异性(Peek and Christendat, 2015)。植物莽草酸脱氢酶基因的沉默会影响植物的茎高生长并出现芳香族氨基酸缺乏等现象(Ding et al., 2007)。

　　在植物中，SDH 通过 N 端与脱氢奎宁酸脱水酶(DQD)结合，形成 DQD/SDH 复合酶。不同的植物因生理特性不同，具有不同的 DQD/SDH 基因数量，在耐铝胁迫的赤桉(Tahara et al., 2021)，成熟的葡萄果实 (Bontpart et al., 2016)、石榴的外表皮(Guo et al., 2014)和山茶的叶片(Huang et al., 2019)中分离到四类 DQD/SDH 基因，白杨编码五种 DQD/SDH 基因(Habashi et al., 2019)。赤桉 EcDQD/SDH1 为经典的植物 DQD/SDH 双功能酶，EcDQD/SDH4a/b 为依赖 NAD+/NADH 的奎尼酸脱氢酶，EcDQD/SDH2 和 3 为铝的解毒代谢物的生物合成提供必需的没食子酸盐(Tahara et al., 2021)。白杨的 poptr1 和 poptr5 皆有典型的 DQD/SDH 双功能特性，而 poptr2 和 poptr3 则以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+ )为辅因子催化奎尼酸形成 3- 脱氢奎尼酸，具有奎尼酸脱氢酶(QDH)活性，DQD 和 SDH 活性最少，只占总活性的 1% (Guo et al., 2014)。

　　莽草酸脱氢酶作为多酚类物质合成的关键分支酶，而酚酸种类丰富且大量的巨尾桉具有不同于其他植物的特点。本研究分离了巨尾桉 EuDQD/SDH6 基因，通过实验设计综合分析该基因在巨尾桉莽草酸脱氢酶家族中的酶功能，为进一步解析桉树莽草酸脱氢酶家族奠定研究基础。

　　1 结果与分析

　　1.1 巨尾桉 EuDQD/SDH6 基因的分离与生物信息学分析

　　根据桉树基因组数据设计引物，分离纯化约 1500bp 符合目的基因的条带，委托华大基因公司测序， Genebank 注册号 KY401152.1。EuDQD/SDH6 开放阅读框全长为 1593bp，预测分子量为 57.48kD，等电点为 7.36。利用在线 IterPro 预测 EuDQD/SDH6 属于莽草酸脱氢酶超家族，也属于脱氢奎尼酸脱水酶第一类。利用 MEGA5.0 检测其他不同植物的 DQD/SDHs 的序列相似性，构建邻接树如图(图 1)。结果表明 EuDQD/SDH6 与 VvSDH3、EgSDH3、FvSDH1 等属于 DQD/SDH 第三分类，平均序列相似性为 85%，猜测 EuDQD/SDH6 功能可能是以 GA 为前体合成单宁，在植物体内积累水解单宁(Bontpart et al., 2016)。

　　1.2 EuDQD/SDH6 的原核表达和酶动力学

　　图中表明 PET-euDQD/SDH6 原核表达载体构建成功(图 2)，预测 PET-euDQD/SDH6 融合蛋白条带可能在 60~70kD 附近，获得原核表达的融合蛋白(图 3)。用 Ni-NTA-琼脂糖亲和纯化 His6 标记的重组蛋白，根据 Michaelis-Menten 线性拟合得到最大速率 Vmax 和米氏常数 Km (表 1)，以莽草酸为底物、NADP+为辅因子的缓冲环境中，DQD/SDH6 的 Km 值为(29.93±0.17) mmol/L，具有功能特性的 DQD/SDHs，其重组酶 Km 值范围大都在 130~860 μmol/L 之间(Ding et al., 2007; Muir et al., 2011;Tahara et al., 2021; Habashi et al., 2019)，说明 DQD/SDH6 以莽草酸为底物的莽草酸脱氢酶活性较低。

　　1.3 EuDQD/SDH6 在巨尾桉中的表达模式

　　以 18S 为内参基因 qPCR 检测巨尾桉组培苗中 EuDQD/SDH6 在不同组织中的表达模式，EuDQD/SDH6 主要在叶片表达，其次是茎部，在根系表达量极低，以根系为对照，EuDQD/SDH6 在叶片的表达量是根系的 20 倍左右(图 4A)。且 EuDQD/SDH6 主要在幼龄叶中表达，随着叶片的成熟表达量随之降低，上层幼龄叶的表达量是下层老龄叶表达量的 121 倍(图 4B)

　　定量 PCR 技术筛选实验室保存的木质素含量降低的转基因巨尾桉 P40、P41 (赵艳玲等, 2018)、F52、 F71、F76 (赵艳玲等, 2019)的 EuDQD/SDH6 基因表达水平，P40、P41 是过表达 CuZnSOD 的转基因桉树， F52、F71、F76 是过表达 CuZnSOD+低表达 4CL1 基因的转基因桉树，筛选到三株 P41、F52、F71 转基因植株的 EuDQD/SDH6 基因表达水平较低，其中 F52 的 EuDQD/SDH6 表达水平最低，与对照组相比下降了 91%。

　　1.4 转基因巨尾桉的 SDH 酶活测定

　　检测筛选的 5 株转基因巨尾桉的 SDH 酶活性，与野生植株相比，转基因巨尾桉的 SDH 活性均有增加，其中 F71 的比活力最高，高达(3.45±0.29)×107 nmol·min-1 ·mg -1，是对照组的 2.22 倍。

　　1.5 转基因巨尾桉的莽草酸、没食子酸和原儿茶酸含量

　　转基因巨尾桉的莽草酸含量均高于对照组，其中植株 F52 莽草酸累积量增加 1.12 倍，而植株 P41 的莽草酸累积量增加 8.19 倍。GA 累积量均低于野生型巨尾桉，并呈现不同程度的减少，其中植株 P40 的 GA 累积量降幅最大，与对照组相比降低 55.75%。转基因巨尾桉 P41、F52、F71、F76 的 PCA 累积量均小幅度的高于野生型巨尾桉，其中 P41 的原儿茶酸含量相对于对照组增加 3.28 倍，与之相反的是植株 P40 的 PCA 累积量呈现轻微的减少。

　　1.6 EuDQD/SDH6 与酚类物质含量的相关性

　　转基因桉树的硫酸木质素含量数据参照文献 [11,12]，以 EuDQD/SDH6 基因表达水平与硫酸木质素含量之间计算，二者的相关系数 r≈0.64，呈显著正线性相关，EuDQD/SDH6 基因可能影响木质素在巨尾桉中的积累。以转基因巨尾桉 SDH 总酶活与硫酸木质素含量计算二者之间的相关系数 r≈-0.88，说明 SDH 的高表达会降低转基因巨尾桉中木质素的累积量。

　　EuDQD/SDH6 的基因表达水平与 SA、PCA 累积量之间呈负线性相关，但 SDH 酶活与 SA 累积量之间呈正线性相关，与 PCA 累积量的正线性相关相对较弱。数据表明 EuDQD/SDH6 基因表达与 GA 累积量之间存在正线性相关，但该关联性较弱，而 SDH 酶活与转基因巨尾桉的 GA 累积量之间存在着较弱的负线性相关。

　　2 讨论

　　Bontpart 等(2016)分析部分双子叶植物的 DQD/SDH 基因序列，将其分成五类：第一类葡萄 VvSDH1、拟南芥 AtSDH(Tahara et al., 2021)、胡桃 JrSDH (Muir et al., 2011)、烟草 NtSDH1 (Ding et al., 2007)，序列相似性达 75%;第二类葡萄 VvSDH2、杨树 poptr2、poptr3 和烟草 NtSDH2，序列相似性平均为 71%;第三类 VvSDH3、野茶树 CasSDH2 (Jiang et al., 2013)、草莓 FvSDH1 (Rivas-Sendra et al., 2011)和桉树 EgSDH3(Boulekbache-Makhlouf et al., 2010)序列相似性最高，高达 85%;第四类葡萄 VvSDH4 和杨树 poptr5, 序列相似性为 77%;第五类杨树 poptr4 和桉树 EgSDH1 等，目前未见生理特性的研究分析，序列相似性平均为 68%。本研究构建的邻接树里，EuDQD/SDH6 与 VvSDH3、CasSDH2、FvSDH1 等归为第三类植物 DQD/SDH，而先前已经有研究证明这四种植物体内积累较高的以 GA 为底物合成的单宁化合物，因此推测桉树 DQD/SDH6 在巨尾桉中的生物功能可能是以 3-DHS 为底物合成没食子酸，为单宁合成提供前体。

　　利用统计学计算公式分析酚酸含量与 EuDQD/SDH6 基因、SDH 酶活和木质素含量之间的相关性，结果发现 SA、PCA 含量与 EuDQD/SDH6 之间呈负线性相关，相关系数分别为-0.51、-0.50，-0.51、-0.57，但与 SDH 酶活之间却呈正线性相关，相关系数分别为 0.61、0.38，说明在巨尾桉中具有一个复杂的莽草酸脱氢酶家族。EuDQD/SDH6 的基因表达水平能较弱的影响 GA 在植物体的累积量;GA 累积量也受 SDH 酶活的影响，当 SDH 酶活力增加时，GA 累积量呈下降趋势，暗示 GA 的合成与 SDH 家族酶关系较小。推测可能存在其他合成 GA 的酶，其以莽草酸作为底物催化产生 GA 的能力较差，或者是否在桉树中存在 GA 合成相关的抑制作用，这些推测还尚未得到证明(Wu and Dutta, 2017)。3-脱氢莽草酸作为中间物既能被 SDH 催化形成 SA，又能被催化生成 GA，而 3-DHS 到 PCA 的途径在植物中的研究尚不清晰，此步骤在植物中是由酶催化的还是无酶催化的还未有定论(Wu and Dutta, 2017; Kim et al., 2018)。

　　统计学方法分析硫酸木质素与 SDH 酶活之间的相关性，结果发现二者之间相关系数为-0.88，表明 SDH 的过量表达能显著降低转基因巨尾桉中木质素的累积。在拟南芥中表达棒状杆菌的脱氢莽草酸脱水酶基因，该酶催化 3-脱氢莽草酸生成 PCA，降低了转基因植物细胞壁木质素的堆积(Eudes et al., 2016)。至于 SDH 表达水平的变化是否能改变木质素的累积量还要通过构建 SDH 转基因植株来进一步验证。

　　3 材料与方法

　　3.1 试验材料

　　巨尾桉组培苗、盆栽苗、转基因苗、大肠杆菌 E.coli DH5α、E.coli BL21、pET-32a 等为本实验室保存。 cDNA 合成试剂盒、RNA 提取试剂盒、定量 PCR 试剂盒和相关的酶试剂购自 TaKaRa，His-tag Protein purification Kit(常州天地人和生物科技)。

　　3.2 基因分离与生物信息学分析

　　参照巨尾桉 RNA 克隆方法(赵艳玲和姚婕, 2017)，设计引物 EuDQD/SDH6：SDH6F：5’ATGGGCAGCG TTCCGTTCAC 3’，SDH6R：5’ATGGGCAGCGTTCCGTTCAC 3’，分离阳性克隆子，委托华大基因测序，NCBI 数据库注册基因序列。蛋白质家族及保守功能结构域预测 InterProScan (http://www.ebi.ac.uk /Tools/InterPro Scan/)，MEGA5.2 建邻接树。

　　3.3 基因原核表达和酶活性测定

　　BamHІ和HindⅢ双酶切pMD-SDH和pET-32a连接构建PET-euDQD/SDH6，并委托华大基因测序。IPTG 诱导 DQD/SDH6 蛋白表达，参照(Habashi et al., 2019)诱导重组蛋白。Ni-NTA beads 6FF 亲和纯化 His6 标记重组蛋白，Bradford 法测定蛋白含量，EuDQD/SDH6 酶动力学参数以莽草酸(SA)为底物、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+ )为辅因子、pH=7 的条件下检测。

　　3.4 实时定量 PCR 测定基因表达量

　　参照(赵艳玲和姚婕, 2017)利用定量 PCR 方法分析巨尾桉组培苗的三个植物组织(根, 茎, 叶)、1 年生转基因桉树盆栽苗不同叶龄(幼叶, 中叶, 老叶)的 EuDQD/SDH6 表达量，以巨尾桉 18s rRNA 为内参基因 Eg18S3：5’CATGGCCGTTCTTAGTTGGT3’，Eg18S4：5’TAGCAGGCTGAGGTCTCGTT3’，EuDQD6(1)： 5’CATTGTGAGAAGGCCTGATG3’，EuDQD6(2)：5’CAGCTAATGGTGAGGCTCCT3’，依相对定量法计算 EuDQD/SDH6 基因的表达量。

　　3.5 转基因巨尾桉 SDH 活性测定方法

　　液氮研磨巨尾桉叶片约 2 g，4 mL 蛋白提取缓冲液抽提，4 ℃ 13 000 g 离心 25 min，取上清为 SDH 蛋白粗提液。Bradford 法测定蛋白含量，以莽草酸(SA)为底物、NADP+为辅因子，紫外分光光度计测定 5 min 内 NADPH 在 340 nm 的吸光度值变化测定莽草酸脱氢酶活性，计算酶活和比活(Bontpart et al., 2016)。

　　3.6 HPLC 法测定莽草酸、没食子酸和原儿茶酸

　　液氮研磨叶片，收集 2.0 g 粉末于锥形瓶中，加入 20 mL 的 50%甲醇。超声仪中提取 60 min，待锥形瓶冷却至室温称重，用 50%甲醇补足重量。0.22 μm 滤膜过滤。HPLC 仪器为 Agilent 高效液相色谱仪，色谱柱为 welch XB-C18 柱(4.6 mm×150 mm, 3 μm)。流动相为乙腈-0.1%磷酸(10:90)，流速 1.0 mL/min，检测波长为 218 nm 测定莽草酸(SA)含量;流动相为甲醇-0.1%磷酸(5:95)，流速 1.0 mL/min，检测波长为 270 nm 测定没食子酸(GA)含量;流动相为乙腈-0.1%磷酸(10:90)，流速 1.0 mL/min，检测波长为 258 nm 测定原儿茶酸(PCA)含量。

　　3.7 酶活性、基因表达量和次级代谢物的相关性

　　以统计学方法计算 EuDQD/SDH6 的表达水平及 SDH 酶活的大小与植物中各类次级代谢物的含量的关系，相关系数计算公式如下：相关系数 r= x、y：两个指标

　　作者贡献

　　赵艳玲、王梅是本研究的实验设计和实验研究的执行人;王梅完成数据分析，论文初稿的写作;赵艳玲是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。两位作者都阅读并同意最终的文本。

　　致谢

　　本研究由福建省科技厅引导性科研项目(2018N0018)资助。