太平洋牡蛎在活品流通过程中的质谱-肽组学分析

　　摘 要 在实验室模拟太平洋牡蛎保活流通过程，采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术(UHPLC-Q-TOF)分析太平洋牡蛎在活品流通过程中内源肽的变化，利用化学计量学方法筛选出各流通阶段的多肽标志物，以期筛选出一组评价太平洋牡蛎活品流通过程中品质变化的新指标。根据肽组学技术对整个活品流通阶段的3个环节(清洗、暂养净化以及无水保活)共7个关键时间点的样品进行内源肽提取，使用UHPLC-Q-TOF分离鉴定，并获得各个流通阶段的肽组轮廓。通过主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)等多元统计分析进行数据挖掘，并筛选出潜在的多肽标志物，经过在线数据库比对，鉴定出多肽氨基酸序列。结果表明，在清洗、暂养净化以及无水保活阶段分别筛选出3、10、8条潜在的多肽标志物。以潜在的多肽标志物DYDPVDK为例，建立可用于日常分析的基于液相色谱-三重四极杆质谱多反应监测(MRM)的分析方法。本研究采用肽组学技术对活品太平洋牡蛎在不同流通阶段的内源肽进行组学表征，筛选出指征不同流通阶段的潜在的多肽标志物，为活品贝类的流通过程提供检测依据。

　　关键词 超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱; 太平洋牡蛎; 肽组学; 多反应监测; 活品流通; 化学计量学

　　《分析试验室》(月刊)1982年创刊，是国内外公开发行的综合性分析化学刊物。《分析试验室》是理论与实践、学术与应用并蓄的专业期刊。

　　1 引 言

　　牡蛎属软体动物门，瓣鳃纲，牡蛎目，牡蛎科，是一种重要的海洋水产资源，其营养丰富，肉质鲜嫩，深受消费者的喜爱。随着世界上贝类海产品的产品结构发生变化，国内外市场上特别是一些内陆地区对鲜活贝类需求也越来越高。因此，需要建立与优化活品牡蛎的生鲜供应链[1～3]，完善活品牡蛎供应链的前提是建立精准的、针对活品牡蛎的品质评价方法。

　　随着捕捞后流通时间的延长，活品牡蛎的体内会发生一系列变化，导致品质不断下降直至死亡。在流通过程中因缺少摄食而需要消耗自身能量物质维持生命活动，造成脂肪、蛋白、糖原等能量物质的下降，以及活力水平(超氧化物歧化酶、ATP等)、风味及营养品质下降。牡蛎活品在流通过程中面临多种环境胁迫，包括饥饿、干露和温度胁迫等，造成流通过程中其品质变化的复杂性。目前，对活品牡蛎在流通过程中的品质评价主要依靠传统的风味指标、能量代谢产物以及生命特征等[1，3]，尚未有国家标准，难以全面反映牡蛎的整体品質[4]。因此，需要不断完善品质评价体系。

　　随着检测技术与分析技术的进步，尤其是高分辨质谱(High resolution mass spectrometry，HRMS)[5]技术的成熟和相关数据处理软件的升级，组学技术已成为品质评价的重要技术[6～9]。近年提出的食品组学技术[10] ，不仅可以解决食品基质复杂的难题[11]，更能从整体生物学角度分析品质[9]。肽组学是一个来源于蛋白质组学的新兴领域[12]，研究生物样本中的所有内源性多肽，可缩小蛋白组与代谢组的差距[13] 。肽组学与蛋白质组学的技术方法体系有许多相似之处，但在分析内容如研究对象、解析深度等方面也存在显著差异。总体而言，在以质谱技术为基础的组学分析中，肽的分析难度小于完整蛋白，因此，肽作为分析目标与蛋白相比更具吸引力。目前，蛋白组被广泛应用于水产品品质变化的检测，如Bosworth等[14]对受低氧胁迫的斑马鱼的鱼肉进行研究分析，发现低氧对6种低丰度蛋白产生影响，而不影响蛋白的表达模式，而肽组学技术则多被应用于食源性活性肽结构的鉴定，如Wu等[15]利用肽组学中的LC-MS/MS并辅以定量构效关系对大豆蛋白源ACE抑制肽进行了纯化和表征，阐明5条三肽序列分别为IVF、LLF、LNF、LSW和 LEF; 肽组学也被用于人类疾病标志物的筛查[12，16]。但在活品牡蛎流通过程中内源肽是否发生变化以及结构鉴定方面尚未见报道。

　　本研究采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UHPLC-Q-TOF)技术，结合化学计量学方法，分析筛选出各流通阶段活品太平洋牡蛎潜在的多肽标志物，并建立了可用于日常分析的基于液相色谱-三重四极杆质谱多反应监测(MRM)的分析方法。本研究利用肽组学技术阐明太平洋牡蛎在流通阶段内源肽的变化规律，并筛选出太平洋牡蛎在活品流通过程中与品质变化有关的多肽标志物，以期建立一组分子水平上的评价指标，完善活品牡蛎的品质评价体系。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　Nexera X2 30A高效液相色谱仪(日本岛津公司); 1290高效液相色谱(美国Agilent 公司); AB SCIEX Triple TOF 5600质谱仪、Triple QuadTM 5500三重四极杆质谱仪(美国SCIEX 公司); MQS50001型超纯水系统(美国Millipore公司)。

　　甲酸(质谱级)、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA) (美国Sigma公司); 乙腈(美国Fisher公司); 其它试剂均为分析纯。

　　2.2 实验方法

　　2.2.1 样品的采集 活品太平洋牡蛎选用山东乳山(36°49′38.66′′ N，121°42′3.84′′E)的2 龄贝[壳高(108.32± 2.5 )mm，体质量(76.23±3.5)g]，确保每组实验样品大小均一，采捕于2018年4月。太平洋牡蛎捕捞到岸后，加冰运至实验室，立刻取出30只牡蛎作为起始点(编号为a组)，并对牡蛎进行常规清洗，再次取样(编号为b组)。清洗后，对太平洋牡蛎进行暂养净化处理24 h，进行真空包装，于4℃进行保活实验(1～9 d)，于第1、3、5、7和9 d进行取样。

　　2.2.2 多肽样品制备 按上述采样时间准时采样，随机采取30只牡蛎，迅速取可食部位并用液氮速冻后研磨。取20 g研磨后的粉末，95℃加热灭酶10 min，在4℃以15000 r/min离心15 min，收集上清液，得肽粗提液。