代谢工程改造嘌呤合成途径以提高核黄素产量

　　摘要 核黄素(riboflavin)又名维生素 B2，是人体必不可少的营养物质之一，而鸟苷三磷酸(guanosine triphosphate, GTP)则是核黄素合成的重要前体。为在高产菌株的基础上进一步提高核黄素产量，该研究以高产核黄素的枯草芽孢杆菌 S1 为出发菌株，利用 CRISPER/Cas9 介导的基因组碱基编辑技术对嘌呤合成途径阻遏蛋白基因以及 GMP 还原酶基因进行失活，并利用质粒过表达的方法进行了一系列的代谢工程改造。结果显示，guaC 基因的失活阻断了 GMP 到 IMP 的回补途径，使 GMP 得到积累，使核黄素产量达到 3.04 g/L，而 purR 基因的失活没有效果;使用 PvegI 启动子过表达希瓦氏菌来源的 ribA 后，核黄素产量提高到 3.33 g/L。将失活 guaC 基因与 PvegI 启动子过表达希瓦氏菌 ribA 结合，最终使核黄素产量达到 3.43 g/L，较出发菌株核黄素产量提升 22%，转化率提升 25.8%。

　　关键词 核黄素;鸟苷三磷酸;枯草芽孢杆菌;碱基编辑器;过表达;代谢工程改造

　　谷振宇; 夏苗苗; 苏媛; 刘川; 罗华军; 张大伟 食品与发酵工业 2022-01-18

　　核黄素，又名维生素 B2，是人和哺乳动物生长必不可少的一种营养物质，在生物体内参与多种氧化还原反应，尤其在作为黄素酶类的辅酶参与细胞中传递氢的相关代谢中起到了重要的作用[1]。比如，核黄素转化为活性形式：黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，FAD)和黄素单核苷酸(flavin mononucleotide，FMN)可以参与促进生物体内碳水化合物的合成、脂肪酸代谢以及呼吸电子链传递[2]。由于哺乳动物自身不能合成核黄素，因而其在饲料行业、食品医药行业中都着有广泛的应用[3-4]。

　　鸟苷三磷酸(guanosine triphosphate, GTP)是核黄素生物合成的直接前体[5]，它既可以以糖和氨基酸为底料进行从头合成，也可以利用嘌呤碱为前体进行补救合成。嘌呤从头合成途径将戊糖磷酸途径生成的 5-磷酸核糖(ribose 5-phosphate，R5P)最终转化成 GTP 和腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)。以合成 GTP 为例，其主要可以分为嘌呤操纵子催化 5-磷酸核糖-1-焦磷酸(5- phosphoribosyl 1-pyrophosphate，PRPP)生成肌苷酸(inosincacid,inosinemonphosphate，IMP)，以及 IMP 催化生成 GTP 两个阶段。根据文献报道，发酵过程中添加 GTP 可以提高核黄素产量[6-7]，证明嘌呤前体的有效供应对核黄素的生产至关重要。并且利用代谢工程策略增强 GTP 的合成也已有很多报道[8-10]。

　　本文选用的核黄素高产菌株 S1 在 5 L 发酵罐中发酵 52 h，核黄素产量可达 27 g/L。本研究在此基础上利用基于 CRISPR-Cas9 的碱基编辑器失活嘌呤操纵子阻遏蛋白基因以及 GMP 还原酶来分别提高 GTP 合成中 2 个阶段的通量。另一方面尝试过表达 GMP 到 2,5-二氨基-6-(5-磷酸-D-核糖氨基)嘧啶-4(3H)酮(DARPP)合成途径的基因以增强 GTP 的合成，最终结果表明 2 种方法的组合使核黄素产量有较大的提升。

　　1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验菌株与质粒

　　论文中涉及的菌株见表 1-1，质粒见表 1-2。

　　1.1.2 主要培养基

　　LB 培养基：酵母提取物 0.5%，蛋白胨 1%，NaCl 1%;灭菌前用 NaOH 调节 pH 值至 7.2， 121 ℃灭菌 20 min。 SX 培养基：酵母提取物 0.5%，蛋白胨 1%，NaCl 0.5%;灭菌前用 NaOH 调节 pH 值至 7.2， 121 ℃灭菌 20 min。发酵培养基 YP：玉米浆干粉 0.5%，蔗糖 1%、硫酸镁 0.5%，酵母抽提物 0.5%，磷酸氢二钾 0.3%，磷酸二氢钾(0.2%)，灭菌前用 NaOH 调节 pH 值至 7.2，121 ℃灭菌 20 min。补料培养基：一水葡萄糖 72%，玉米浆干粉 1.5%，磷酸二氢钾 0.030%，灭菌前用 NaOH 调节 pH 值至 7.2。115 ℃灭菌 30 min。

　　1.1.3 仪器与设备

　　GET3XG 三槽独立梯度基因扩增仪，杭州柏恒科技有限公司;水平电泳仪，北京市六一仪器厂; 94-Z 水平摇床，宁波新芝生物科技股份有限公司;V-1600 可见分光光度仪，上海美谱达仪器有限公司;SBA-40E 生物传感分析仪，山东生物传感器重点实验室。

　　1.2 方法 1.2.1 嘌呤合成途径基因过表达及失活菌株构建方法

　　本实验所涉及的基因序列均来自 NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，使用 SnapGene 设计所用引物，由金唯智生物公司合成(表 2)。

　　1.2.2 嘌呤合成途径基因过表达及失活菌株的构建 1.2.2.1 质粒构建

　　以 SG 质粒为例，以 pHP13-spe-PvegI-mcherry 质粒为模板，用引物 pHP131、PvegI-2 扩增含壮观霉素抗性基因以及 PvegI 启动子的 pHP13 质粒骨架，以 B. subtilis 168 基因组为模板，用引物 UPgmk、DN-gmk 扩增 gmk 基因片段，将扩增出来的 2 个片段用 Gibson 试剂盒两片段连接，化学转化 DH5α 后，挑取长出的菌落用 CXPHP131、CXPHP132 引物进行验证，正确的转化子大小为 1 293 bp，验证且测序正确后接入无抗的 LB 培养基中培养 14~17 h 提取质粒。

　　1.2.2.2 嘌呤合成途径基因过表达

　　向目的菌株中用电转化[11]的方法转入相应基因的过表达质粒，以终质量浓度为 150 µg/mL 的壮观霉素进行筛选获得正确的转化子后保藏。

　　1.2.2.3 碱基编辑器质粒的构建及嘌呤合成途径基因失活

　　碱基编辑器失活 guaC 和 purR 的质粒基于实验室中构建的碱基编辑器质粒 pHP13-spe-dcas9。质粒以 pHP13 为骨架包含复制起始位点 Puc ori，复制蛋白 Pep pTA1060，壮观霉素抗性基因 spe。其余部分包括乳糖/IPTG 诱导的阻遏蛋白基因 lacI，PgraC 启动子表达 dcas9 及脱氨酶(adenosine deaminase，AID)，其中 dcas9 缺失终止密码子，PvegI 启动子连接仅缺少 N20 的向导 RNA。在插入 N20 序列时，首先需要找到相应基因序列前中段合适的 NGG 序列，NGG 序列上游 20 bp 为 N20 序列，由于在 NGG 上游 15~20 bp 更容易利用碱基编辑器发生编辑，所以在 NGG 上游 15~20 bp 寻找使 C 变为 T 而产生终止密码子的突变，设计 N20 以构建质粒。以 PDC 质粒为例，以 pHP13-spe-dcas9 质粒为模板，用引物 UP-dcas9-guaC、DN-dacs9 扩增片段 1，用引物 UP-dac9、DN-dcas9-guaC 扩增片段 2，将扩增出来的 2 个片段用 Gibson 试剂盒两片段连接，化学转化 DH5α 后，挑取长出的菌落用CX13spe2、CXJF2 引物进行验证，正确的转化子大小为 624 bp，验证且测序正确后接入无抗的 LB 培养基中培养 14~17 h 后提取质粒。向目的菌株中用电转化的方法转入相应基因的碱基编辑器质粒，以终质量浓度为 150 µg/mL 的壮观霉素进行筛选获得正确的转化子后，进行传代培养使目的位点发生编辑并且使质粒丢失，影印后对质粒丢失的菌进行测序，得到相应密码子突变成终止密码子的菌株进行保藏。

　　1.2.3 核黄素浓度的测定

　　取 500 µL 发酵液样品于 1.5 mL EP 管中，用 0.1 mol/L NaOH 溶液稀释适宜倍数，避光碱溶 20 min 取出，12 000 r/min 离心 1 min，取上清液用分光光度计检测 444 nm 处的吸光度值，以确定核黄素的浓度[12]。

　　1.2.4 残糖测定

　　取 500 µL 发酵液样品于 1.5 mL EP 管中，12 000 r/min 离心 1 min，取上清液用无菌水稀释适宜倍数后，用进样针取样，用生物传感分析仪对样品的残糖进行检测。

　　1.2.5 蔗糖测定

　　取 200 µL 发酵液样品于 1.5 mL EP 管中，加入 200 µL 配置好的 2 mol/L H2SO4溶液，于 60 ℃水浴锅中水解 30 min，加入 4 mol/L NaOH 溶液 200 µL 进行中和，12 000 r/min 离心 1 min，取上清液用无菌水稀释适宜倍数，用生物传感分析仪对样品水解后的葡萄糖进行检测，蔗糖的浓度为测得的葡萄糖浓度的 2 倍。

　　1.2.6 摇瓶补料发酵验证

　　从﹣80 ℃冻存管中取 3 µL 菌液于含有 1 mL 无菌水的 EP 管中，10 倍稀释后混匀，取 3 µL 涂布 SX 平板，37 ℃倒置培养 48 h，挑取直径 5~6 mm 的 1 个单菌落接种 2 支固体试管 SX 含相应抗性的斜面培养基，37 ℃静置培养 48 h。用 1 mL YP 培养基清洗下 1 支斜面上的所有菌苔于 2 mL EP 管中，混匀，取 300 µL 菌液分别接种于含有 80 mL YP 培养基的 500 mL 瓶底有挡板的三角瓶中， 37 ℃，180 r/min 振荡培养 41 h。培养过程中分别在 11 和 23 h 加入补料培养基进行补料发酵。

　　2 结果与分析 2.1 嘌呤合成途径基因失活及补料发酵验证

　　根据文献报道，purR 基因编码嘌呤合成途径的阻遏蛋白 PurR，敲除 purR 基因可使嘌呤合成途径基因转录水平大幅提升[13-14]：guaC 基因为嘌呤合成途径 GMP 还原酶编码基因，敲除 guaC 基因[15]可阻断 GMP 到 IMP 的合成，从而使 GMP 得到一定的积累，间接提高核黄素的产量。因此对这 2 个基因用 CRISPER/Cas9 介导的基因组碱基编辑器技术进行失活[16-17]，分别得到菌株 SDR 和 SDC，并对这 2 个菌株进行补料发酵验证。

　　由图 2-2 可知，嘌呤合成途径的阻遏蛋白 purR 碱基编辑器失活后产量从 2.81 g/L 降至 2.68 g/L，证明高产菌 S1 中嘌呤合成途径由 PRPP 到 IMP 部分基因转录水平足够满足核黄素的合成，不是该途径中的限速步骤;而嘌呤合成途径的回补途径基因 guaC 碱基编辑器失活后，阻断了 GMP 到 IMP 的合成，产量由 2.81 g/L 提升至 3.04 g/L，产量提升 8%。41 h 时 S1 菌以及 SDR 菌葡萄糖有少量剩余， SDC 菌葡萄糖剩余 2.67 g/L(图 2-3)，17 h 时摇瓶内蔗糖已耗尽。SDC 菌株核黄素转化率由 S1 菌株 1 g 糖(0.392 g 蔗糖、0.608 g 葡萄糖)产 0.027 5 g 核黄素提高至 1 g 糖(0.399 g 蔗糖、0.601 g 葡萄糖)产 0.030 3 g 核黄素，转化率提升 10.2%。

　　2.2 嘌呤合成途径基因过表达

　　以上实验表明 guaC 基因失活使产量有所增加，推测 GMP 的供给并没有达到饱和。基于此推论，尝试了将 gmk 和 ndk 基因进行过表达(gmk 编码鸟苷酸激酶，催化 GMP 生成 GDP，ndk 编码核苷二磷酸激酶，催化 GDP 生成 GTP)，期望通过增加 GMP 的消耗拉动 IMP 向 GMP 的转化过程。因此对这 2 个基因以 pHP13 为质粒骨架，PvegI 为启动子构建质粒 PG 和 PN，电转化进 S1 菌株，分别得到菌株 SG 和 SN，并且用携带不含启动子及目的基因的空载质粒 S1-空菌株作为对照，进行补料发酵验证。

　　由图 3-1 可知，过表达 gmk 及 ndk 后对菌株生长无明显影响。图 3-2 为核黄素终产量，与对照菌株 S1-空相比，SG 菌株及 SN 菌株产量无明显提高，41 h 时葡萄糖无剩余(图 3-3)，17 h 时摇瓶内蔗糖已耗尽。这说明单独表达这 2 个基因并没有拉动 GMP 的合成，而 GTP 进入核黄素合成途径可能是更关键的反应。

　　2.3 ribA 基因异源引入及过表达

　　根据文献报道以及 BRENDA 数据库(https://www.brenda-enzymes.info/index.php)查询得到枯草自身 RibA 双功能酶(EC 3.5.4.25 及 EC 4.1.99.12)，但该酶无法将 2 个酶的功能拆分，为了将 GTP 环水解酶 II 单独过表达，查找到希瓦氏菌来源的 ribA(EC 4.1.99.12)。以 pHP13 为质粒骨架，以 PvegI 及 Pr 为启动子分别对希瓦氏菌 ribA 基因进行过表达，构建质粒 PSA 和 PRA，电转化进 S1 菌株，分别得到菌株 SSA 和 SRA，用含空载质粒的 S1-空菌株作为对照，进行补料发酵验证。

　　图 4-1 可知，S1-空菌株最大 OD600为 32.2，SSA 及 SRA 菌株最大 OD600有不同程度的下降，分别为 30.2 和 23.3。表明希瓦氏菌 ribA 的表达对菌的生长产生一定的影响，可能与 GTP 在 GTP 环水解酶 II 催化下产生的(DARPP)具有一定的细胞毒性有关。而 Pr 启动子表达强度强于 PvegI 启动子，对菌的生长抑制也表现的较为明显，导致核黄素产量下降。图 4-2 为发酵结束时核黄素终产量， SSA 菌产量提升至 3.33 g/L，并且发酵结束摇瓶中仍有 4.6 g/L 的葡萄糖剩余。而 SRA 菌产量则明显下降至 2.69 g/L，耗糖进一步减少，发酵结束摇瓶中葡萄糖剩余 18.4 g/L(图 4-3)，17 h 时摇瓶内蔗糖已耗尽。SSA 菌株核黄素转化率为 1 g 糖(0.407 g 蔗糖、0.593 g 葡萄糖)产 0.033 8 g 核黄素，转化率较 S1 提升 22.9%。

　　2.4 guaC 基因失活及 ribA 基因过表达组合验证

　　由以上实验可知，失活 guaC 基因可以提高 GMP 的供给，PvegI 启动子过表达希瓦氏菌来源的 ribA 基因可以加快 GTP 的利用，从而拉动嘌呤途径产物的合成使核黄素产量增加，并且认为这 2 种效果是可以叠加的。于是在失活 guaC 基因的 SDC 菌中分别转入 PSA 质粒以及 PRA 质粒，得到菌株 SDCA 和 SDCR，并将 pHP13-spe 空载质粒转入 SDC 菌中得到菌株 SDCS，用 SDCS 菌株作为对照，进行补料发酵验证。

　　图 5-1 表明，摇瓶补料发酵时 Pr 启动子表达希瓦氏菌来源 ribA 在 SDC 菌中仍会抑制生长。 SDCA 菌株产量进一步提升，达到 3.43 g/L，相较于 SDCS 菌产量进一步提高 9.2%，相较于初始菌株 S1 产量提升 21.7%(图 5-2);并且 SDCA 菌耗糖也有所减少，发酵结束时摇瓶中剩余葡萄糖 3.87 g/L。SDCS 菌发酵结束时没有葡萄糖剩余(图 5-3)，SDCA 菌株转化率为 1 g 糖(0.404 g 蔗糖、 0.596 g 葡萄糖)产 0.034 6 g 核黄素，较 S1 菌株提升 25.8%，具有一定的工业生产应用价值。

　　3 结果与讨论

　　S1 是一株经过诱变及筛选所得的核黄素高产枯草芽孢杆菌高产菌株，但核黄素合成必须的鸟嘌呤合成途径并未发生突变。为了使 S1 菌株核黄素合成能力进一步提升，主要对嘌呤合成途径的相关基因进行失活以及质粒过表达，结果如下：

　　(1)嘌呤合成途径支路基因失活：运用 CRISPER/dCas9 介导的基因组碱基编辑器技术失活 guaC 基因(编码 GMP 还原酶)，阻断了 GMP 到 IMP 的合成，核黄素产量由 2.81 g/L 提升至 3.04 g/L，提升 8.2%，转化率提升 10.2%。(2)嘌呤合成途径下游基因过表达：通过质粒将 GMP 下游合成基因 gmk(鸟苷酸激酶)和 ndk (核苷二磷酸激酶)进行过表达，核黄素产量没有明显提升，由此确定了这两步反应不是核黄素合成的瓶颈。(3)希瓦氏菌 ribA 基因引入及过表达：枯草芽孢杆菌中 ribA 基因编码的蛋白为一种双功能酶，希瓦氏菌中 ribA(EC 3.5.4.25)和 ribB(EC 4.1.99.12)2 种酶可以拆分单独存在，故单独引入了希瓦氏菌 ribA 基因(EC 3.5.4.25)，过表达 GTP 环水解酶 II 部分，将 GTP 更多的转化为 DARPP，增强嘌呤前体的利用。在摇瓶补料发酵中核黄素产量由 3.09 g/L 提升至 3.33 g/L，并且耗糖有所减少，发酵结束时葡萄糖剩余 4.6 g/L，核黄素转化率较 S1 提升 22.9% (4)将 guaC 基因失活与希瓦氏菌 ribA 基因过表达进行组合，核黄素产量进一步提升至 3.43 g/L，较初始菌株 S1 产量提升 21.7%，并且耗糖有少量减少，核黄素转化率提升 25.8%，具有一定的工业生产价值。