多重PCR技术可鉴定杂交水稻种子纯度

　　摘 要 为建立一种利用多重 PCR 技术对水稻多个基因位点进行同步检测的方法，本研究以„丰田优 553‟、 „吉丰优 3550‟及其杂交种子为试验材料，根据不同 SSR 分子标记的扩增片段差异，筛出亲本间差异明显的 SSR 分子标记，然后设计多重 PCR 鉴定杂交水稻种子的纯度，并与普通 PCR 的鉴定结果进行对比分析，验证多重 PCR 鉴定杂交水稻种子纯度实用性。结果显示，共筛选到 48 对 SSR 分子标记，其中„丰田 1A‟ 与„桂恢 553‟之间的差异性引物有 23 对;„吉丰 A‟与„广恢 3550‟之间的差异性引物有 24 对。根据 PCR 扩增片段大小的差异，对两个杂交组合设计的两组双重 PCR 的纯度鉴定发现，普通 PCR 的鉴定结果与多重 PCR 的结果一致。说明多重 PCR 能够对多个水稻基因位点进行同步检测，为杂交水稻种子纯度的鉴定提供技术参考。

　　本文源自马增凤; 韦敏益; 黄大辉; 张月雄; 刘驰; 罗同平; 李振经; 秦钢， 分子植物育种 发表时间：2021-02-23 《分子植物育种》杂志，于2003年经国家新闻出版总署批准正式创刊，CN:46-1068/S，本刊在国内外有广泛的覆盖面，题材新颖，信息量大、时效性强的特点，其中主要栏目有：新技术、新方法 、学术论坛与信息等。

　　关键词 多重PCR; 纯度鉴定; 杂交水稻; 同步检测

　　杂交水稻的成功研究与大面积推广应用为中国乃至世界的粮食安全做出了巨大贡献(朱国奇等, 2015)。杂交水稻质量的优劣直接关系到中国乃至世界粮食生产安全，而加强杂交稻种子质量管理是提高中国杂交稻种子质量水平的必经途径。种子纯度为种子质量好坏的衡量标准之一，对种子纯度检测是防止良种混杂退化、提高种子质量和产品品质的必要手段(朱玉君等, 2009; 宗凯等, 2018)。SSR 分子标记在水稻基因组中分布比较均匀，且具有重复性好、稳定性高、成本较低和易于操作等优点，是室内鉴定种子纯度最常用的方法(谭智丹等, 2006; 张安宁等, 2013; 王立广等, 2020)。目前，多重 PCR 检测多用于病原微生物的同时检测(谢婷艺, 2017,白菊红等, 2019)，对于杂交水稻种子纯度的检测尚没有报道。朱国奇等(2015)采用 SSR 分子标记对 500 家种子企业的 20 000 多份杂交种子的样本进行纯度检测，大多数结果与大田结果相吻合，但在检测中发现，有的样品采用不同的 SSR 引物检测时结果出现很大的差异。宗凯等(2018)利用多对 SSR 标记引物鉴定两系杂交水稻的种子纯度，结果发现，不同引物对同一样品的鉴定结果通常存在差异，SSR 标记与田间鉴定结果均接近，相差最大一组差异为 3.3%，最小的差异值 0.04%，因此认为筛选合适的、多对引物同时对同一组样品进行测定是有价值的，也是有必要的。

　　由于不同的 SSR 引物检测结果出现很大的差异，采用多对引物的普通 PCR 鉴定又会增加鉴定成本。因此，本研究旨在建立一种利用多重 PCR 技术对水稻多个基因位点进行同步检测的方法，探讨多重 PCR 在杂交水稻品种纯度快速鉴定中的应用。为杂交水稻种子纯度的鉴定提供技术参考。

　　1 结果与分析

　　1.1 引物间的目标片段大小差异相对较大

　　对 48 对引物进行筛选，„丰田优 553‟亲本间有 23 对引物差异明显，„吉丰优 3550‟亲本间有 24 对引物多态性较好。在筛选出来的亲本间有差异的引物中按照带型比较单一，亲本间带型差异明显、位于不同染色体，且引物间的目标片段大小差异相对较大(最好在 40-60bp 之间)的原则，选择多重 PCR 的检测引物。如图(图 1)中所示，引物 A(RM583)与引物 B(RM471)亲本差异明显，两个引物的目标片段大小差异相对较大，所以可以选择作为双重 PCR 的检测引物;同样引物 C 与引物 D 也符合这个原则选择作为双重 PCR 的检测引物;引物 A、B 和 D 相互间的目标片段大小差异也相对较大，可以考虑用作三重 PCR 的引物。根据以上原则，最终选择检测„丰田优 553‟种子纯度的引物是：RM583、RM471、RM3331、RM424;检测„吉丰优 3550‟的引物是：RM490、RM471、RM432、RM424。

　　1.2 标准 PCR 和多重 PCR 的比较

　　利用引物 RM432、RM490 分别对样品„吉丰 A‟、„广恢 3550‟、3 个 F1 单株以及 3 个杂株进行扩增，双重 PCR 采用 RM432 和 RM490 组合对单一 PCR 同样的样品进行扩增，三重 PCR 采用 RM432、RM490 和 RM424 组合进行扩增。在图中 A 部分是引物 RM432 单独扩增的结果，B 部分是引物 RM490 单独扩增的结果，C 部分是引物 RM432 和 RM490 双重 PCR 扩增的结果，图中 C 部分上半部分的电泳带型与 A 部分相同，即 RM432 的扩增条带是一样的;下半部分的电泳带型与 B 部分相同，即 RM490 的扩增条带也是一样的，且条带清楚易读，证明双重 PCR 并不会影响扩增条带结果(图 2)。由于三重 PCR 是三对引物同时进行 PCR 扩增，在电泳图中扩增条带会分成三层。从图中可以看到电泳条带清晰程度并不一样，位于上层的 RM424 条带和位于下层的 RM490 条带比较清晰，而位于中间位置的 RM432 产生的条带相对于在双重 PCR 中形成的条带就显得很模糊(图 3)，且三对引物扩增产生的条带太多，分析结果的时候读取带型相对困难，对鉴定结果容易产生误判。

　　1.3 双重 PCR 的稳定性试验

　　为验证多重 PCR 在群体中扩增的稳定性，本研究采用两个杂交品种分别设计 2 个双重 PCR 的引物组合，并对相应的样品进行扩增分析(表 1)。结果显示，每对引物所扩增的产物条带，不同引物之间互不影响，可以完全区分开。说明在同一反应孔中添加 2 对引物时，PCR 反应稳定性良好(图 4)。

　　注: M: DL2000 DNA marker; 1: 丰田 1A; 2: 桂恢 553; 3~5: 丰田优 553 F1 单株; 6: 吉丰 A; 7: 广恢 3550; 8~10: 吉丰优 3550 F1 单株; A: RM583+RM471; B: RM3331+RM424; C: RM432+RM490; D: RM471+RM424 Figure 4 Stability detection Note: M: DL2000 DNA marker; 1: Fengtian 1A; 2: Guihui 553; 3~5: Fengtian 553 F1 single plants; 6: Jifeng A; 7: Guanghui 3550; 8~10: Jifeng You 3550 F1 single plants; A: RM583+RM471; B: RM3331+RM424; C: RM432+RM490; D: RM471+RM424

　　1.4 双重 PCR 的检测结果分析

　　为检测双重 PCR 在杂交种子纯度鉴定中的应用情况，本研究一共检测了„丰田优 553‟和„吉丰优 3550‟ 288 个样品。将这些样品分为 3 组，每组 96 个样品。每组用 4 对引物将其分成两个双重 PCR 组合并分析。结果显示，在„丰田优 553‟的 3 组样品中(表 2)，样品 FF1-1 检测出来的纯度为 95.7%，FF1-2 的纯度为 97.9%， FF1-3 的纯度为 94.8%。检测结果的最大值与最小值相差了 2.9%。对 4 对引物鉴定出来的平均纯度进行分析也发现 RM583 在 288 个样品中检测到 7 个杂株，纯度为 97.6%;RM471 检测到 5 个杂株，纯度为 98.3%; RM3331 检测到 7 个杂株，纯度为 97.6%;RM424 检测到 9 个杂株，纯度为 96.9%。说明不同批次鉴定的结果是不一样的，4 对引物鉴定的纯度也有 3 种不一样的结果。

　　在„吉丰优 3550‟的 3 组样品中(表 2)，样品 JF1-1 检测出来的纯度为 97.9%，JF1-2 的纯度为 95.8%，JF1-3的纯度为 96.9%。其中，JF1-1 只检测到了 2 个杂株，而 JF1-3 中有 3 对引物没有检测到杂株，最大值与最小值相差 2.1%。对 4 对引物鉴定出来的平均纯度进行分析发现：RM471 检测出来的纯度为 99.3%，RM424 的纯度为 99.0%，RM432 的纯度为 96.9%，RM490 的纯度为 98.3%，最大值与最小值相差 2.4%。„吉丰优 3550‟的鉴定结果与„丰田优 553‟的鉴定结果均说明，不同组合鉴定的结果不一样，4 对引物鉴定的纯度也不一样。

　　2 讨论

　　目前杂交水稻种子纯度检测需要的样本量还没有统一的标准。郭承亮(2014)认为，利用 SSR 分子技术检测杂交种子纯度一般要选取 1 000 粒种子检测，效果较好。对于一些种子，批数量特别大要选取 2 000 粒种子检测，才能保证检测结果的准确性;宗凯等(2018)利用 SSR 标记检测杂交稻种子纯度时每个样选取了 192 粒，总体的鉴定结果与种植鉴定十分接近;吴柔贤等(2018)通过不同样本量并结合公式则认为 192~288 为合适的检测样本量。在本实验中每个品种分三个批次，每个批次 96 个样品进行检测，在„丰田优 553‟的纯度检测中的三个批次最大纯度与最小纯度相差 2.9%，检测样品量为 192 个时，通过组合分析计算，最大纯度与最小纯度相差 1.5%。理论上选取检测的样品数量越大检测效果就越好，误差就越小，但这无疑增加各个工作环节的工作量，不利于效率提高(吴柔贤等, 2018)，同时也增加了检测的成本。综上，如果再增加一板的检测样品量(96 个)，也就是 288 个的样品，检测的误差就能控制在 1%左右;如果检测的品种数太多(大于 10 个)也可以每个品种只检测 192 个样品。

　　水稻杂交种子纯度鉴定时，应尽可能采用多对引物进行检测(朱国奇等, 2015; 宗凯等, 2018)。理论上检测引物数量越多鉴定结果就越准确，但是，考虑到工作量和成本，很多实验只采用了两对引物进行检测，纯度鉴定的结果准确率还得不到保证。本试验采用双重 PCR 进行检测，可以成倍地降低成本和工作量，采用 2 个组合 4 对引物对品种的纯度进行分析，检测的结果也有所差别。从检测结果来看，不同引物对样品纯度的分子生物学鉴别能力不同，采用位于不同染色体区域的多对引物进行检测，更能保证纯度鉴定结果的可靠性(白占兵等, 2012)。多重 PCR 可以对引物同时检测，不仅减轻了大量的工作量，也节约了检测的时间和成本。

　　依据本次研究发现，多重 PCR 应用于杂交水稻种子纯度鉴定时应注意以下几个方面： (1)选用的引物应尽量位于不同的染色体上，不同的染色体区域，品种间的遗传差异不一样，检测出来的结果也不一致。本研究用于鉴定„丰田优 553‟的引物中，RM424 检测到的纯度最低为 96.9%，RM471 检测到的杂株最少，只有 5 个杂株，纯度为 98.3%，两者的纯度相差是 1.4%;用于鉴定吉丰优 3550 的引物中，RM471 检测出来的纯度最高为 99.3%，RM432 检测出来的纯度最低为 96.9%，两者相差是 2.4%。由此可见，不同的引物对样品纯度的鉴别能力不同，应尽可能的采用位于不同染色体区域的多对引物进行检测。(2)三重及以上的 PCR 不适用于杂交水稻种子的纯度鉴定。首先，在选择差异度比较合适的引物就相对困难;其次，三对引物同时扩增时，中间的引物会受到一定的影响，扩增产生的 PCR 条带比较模糊;再者，三重 PCR 对杂交水稻种子的纯度鉴定，扩增出来的条带太多，加上杂种产生的条带，一般会产生 6~10 个条带，检测结果混乱，容易产生误判。相对于三重 PCR，双重 PCR 的效果就好多了，引物组合的选择也相对容易得多，在 PCR 反应的稳定性，条带的区分度方面都比三重 PCR 要好。(3) 利用双重 PCR 检测杂交种子时，2 对引物同时扩增 2 个亲本就会产生 4 条主条带，另外有些引物还存在扩增出副带的问题，在这种情况下，因为条带数量过多，若下层的引物在亲本间扩增的条带差异过大(超过 40 bp)，就会与上层的引物扩增的条带掺杂在一起，导致无法准确读带，因此同一引物在两个亲本间扩增的条带差异不宜过大，在 5~10 bp 为较佳，同时，不同引物在同一亲本间扩增的条带差异在 50 bp 以上为较佳，在这种情况下，两对引物扩增的条带能有明显的分隔，有利于对鉴定结果的判断。

　　多重 PCR 能对多个水稻基因位点进行同步检测，该方法简单、快速又准确，可以利用于杂交水稻种子纯度的鉴定，而相对于三重 PCR，双重 PCR 更适用于水稻杂交种子的纯度鉴定。

　　3 材料与方法

　　3.1 供试材料

　　供试杂交水稻组合为„丰田优 553‟和„吉丰优 3550‟，„丰田优 553‟、母本„丰田 1A‟和父本„桂恢 553‟由广西农科院水稻研究所提供，„吉丰优 3550‟、 母本„吉丰 A‟和父本„广恢 3550‟由广东省农科院水稻研究所提供。所有试剂及引物均购自上海生物工程有限公司。

　　3.2 标记选择

　　采用 NY/T1433-2014 附录 C 中推荐的 48 对 SSR 引物，对双亲及杂交种子进行多态性筛选。选用在双亲中具有较好多态性的 SSR 引物(表 3)。

　　3.3 种子发芽

　　随机选取超过 300 粒杂交水稻种子和 10 粒双亲种子，放入发芽盒，置于 30℃恒温箱中发芽 5 d。

　　3.4 DNA 提取

　　(1)分别取水稻幼嫩叶片加入 2 mL 离心管，放入钢珠，用研磨仪磨碎;(2)加入 650 μL 65 ℃预热的 2% CTAB 提取缓冲液;(3) 65 ℃水浴 30 min，其间轻摇 2~3 次;(4)加入等体积氯仿;用力摇匀 1~2 min;(5) 10 000 r/min 离心 5 min，将上清液转入一个新的 1.5 mL 的离心管中(步骤(4)~(5)可重复 1~2 次);(6)加入 2 倍体积-20 ℃预冷的无水乙醇，混匀，低温放置 10 min;(7) 10 000 r/min 离心 3 min，弃上清;(8) 70%乙醇清洗，吹干;(9)将 DNA 溶于 ddH2O 中。

　　3.5 普通 PCR 扩增

　　反应体系(10 μL)：PCRmix (中科瑞泰生物技术有限公司) 5 μL，ddH2O 3 μL，DNA 模板 1 μL，正反向引物各 0.5 μL。反应程序：95 ℃预变性 5 min;95 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共 30 个循环;72 ℃再延伸 5 min。PCR 反应产物采用 8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

　　3.6 多重 PCR 扩增

　　反应体系：在普通 PCR 的基础上多加入 1~2 对的引物，其他成分和用量不变。反应程序与普通 PCR 相同。

　　3.7 纯度的计算方法

　　纯度的计算方法：样品纯度=(样品总数-杂种数)/样品总数*100%