不同氮肥对西南蜡梅幼苗生长及根际土壤细菌群落的影响

　　摘要：以盆栽西南蜡梅为试材,对西南蜡梅种植土壤施用不同氮肥(CK、N1(NH4NO3)、N2(KNO3)、N3(C2H5NO2)、N4(NH4Cl)),采用荧光定量PCR和变性梯度凝胶电泳技术,研究不同氮肥对西南蜡梅根际土壤细菌群落的影响,分析其理化性质、土壤细菌群落及植物生长的关系,以期为西南蜡梅推广栽培、科学施肥和保护土壤生态系统提供参考依据。结果表明:氮肥处理后植株株高和干质量均高于CK,且均为N1最高;qPCR结果显示,与CK相比,N1的根际细菌拷贝数最高;DGGE图谱分析显示,氮肥处理后的土壤细菌多样性指数均大于对照;相关性分析表明,细菌拷贝数及多样性指数均与西南蜡梅幼苗植株生长呈极显著相关(P<0.01)。综合分析,不同氮肥处理对植株生长发育和土壤微生物数量及群落结构影响明显,施NH4NO3对盆栽西南蜡梅幼苗植株生长发育及根际土壤细菌拷贝数、多样性指数促进作用最好。

　　本文源自北方园艺,2020(19):86-93.《北方园艺》是由黑龙江省农科院主管、黑龙江省园艺学会和黑龙江省农科院主办的以科学研究和技术普及相结合的园艺类综合性科技期刊。创刊于1977年，国内外公开发行。本刊多年来已形成了自己的办刊特色，受到全国农业科研、教学、生产第一线等科技人员和广大读者的热情支持和欢迎，既是科技人员技术交流和发布佳篇新作的信息平台，也是园艺种植户的致富帮手和秘籍锦囊。

　　氮肥对植物生长至关重要,氮素是植物生长发育所必需的大量营养元素,其中NO-3-N和NH+4-N是植物主要吸收的氮素形态,而尿素和氨基酸等有机氮也可被植物吸收[1]。不同氮肥对植物生长存在着不同影响,研究发现与硝态氮相比,施用铵态氮对尾赤桉(E.uophylla×E.camaldulensis)幼苗株高、水稻(Oryzasativa)幼苗干鲜质量的促进效果更好[2,3],而施用硝态氮对菠菜(Spinaciaoleracea)和黄檗(Phellodendronamurense)幼苗的株高[4,5]、小白菜(Brassicachinensis)地上部分及根的干鲜质量有促进作用[6]。不同的研究结果显示,相比铵态氮和硝态氮,施用甘氨酸对红松(Pinuskoraiensis)幼苗的株高和干质量促进最明显[7]。另外,研究表明以硝态氮和铵态氮混合施肥对生长影响也不同,如张雪等[8]和许楠等[9]发现,与施用单一氮素相比,氮素为NO-3∶NH+4=1∶1时,对黄瓜(CucumissativusL.)幼苗的干鲜质量和桑树(MorusalbacvQinglong)幼苗的干鲜质量、株高促进作用最明显,但康晓育等[10]却发现单独施用铵态氮和硝态氮后的平邑甜茶(M.hupehensis(pamp)Rehd)干鲜质量均明显高于铵态氮+硝态氮处理。

　　细菌是土壤中含量最多、丰富度最高和分布最广泛的微生物类群,通常占土壤微生物的70%～90%,能有效促进有机质分解、营养物质的释放,在土壤生态过程中有着不可或缺的地位[11,12]。土壤细菌对外界干扰比较敏感,是土壤生态系统变化的预警指标,常用于评价土壤生态系统的健康程度。施用氮肥对土壤细菌影响存在差异,研究发现,与施用硝态氮和有机氮肥相比,施用铵态氮对红菜薹(Brassicarapa)幼苗根际土壤细菌数量促进作用更明显[13],而不同研究结果显示硝态氮对豫麦50(TriticumaestivumL.)的根际土壤细菌数量促进作用更好[14]。不同氮肥对土壤微生物多样性也会产生差异,研究发现,与不施肥相比,有机氮(甘氨酸)对苗期的大豆(Glycinemax(Linn.)Merr.)土壤微生物多样性具有促进作用,但铵态氮和硝态氮处理对多样性均为抑制作用[15],而不同的研究结果显示铵态氮、硝态氮和有机氮(甘氨酸)对番茄(Lycopersiconesculentum)幼苗根际土壤微生物均有促进作用[16]。因此,研究氮肥对植物根际土壤微生物群落的影响能为建立合理施肥制度、提高土壤肥力和实现土壤可持续利用提供科学依据。

　　西南蜡梅(Chimonanthuscampanulatus)是我国西南地区特有品种,野生状态下分布于云南禄劝、麻栗坡及贵州南部等地[17]。目前对西南蜡梅的人工栽植培育研究相对较少,不利于西南蜡梅的栽培及资源开发与利用。该试验通过研究不同氮肥施用对盆栽西南蜡梅生长、土壤理化性质和根际土壤细菌群落的影响,比较分析西南蜡梅生长、土壤理化性质和根际土壤细菌群落间之间的关系,明确西南蜡梅生长对氮肥吸收的特性,为西南蜡梅推广栽培、科学施肥和改善土壤生态系统提供借鉴。

　　1、材料与方法

　　1.1试验地概况

　　试验地位于云南省昆明市盘龙区西南林业大学后山树木园(东经10°46′,北纬25°04′),属北亚热带低纬高原山地季风气候,年平均气温16.5℃,年均降雨量1450mm。

　　1.2试验材料

　　供试材料为西南蜡梅种子(采自昆明黑龙潭公园),栽培土壤为红壤,土壤基本理化性质为:有机质含量1.024%,pH6.77,电导率375.8μS·cm-1,铵态氮含量0.362mg·kg-1,硝态氮含量3.485mg·kg-1,全氮含量1.040g·kg-1,全磷含量2.203mg·kg-1,全钾含量20.385mg·kg-1,土壤经5mm钢筛过筛后混匀,装入栽培盆中(口径16cm×高度14cm),每盆均装土1kg。种子于2018年6月播种于育苗盆中。

　　1.3试验方法

　　待长出4片真叶时,选取长势一致的幼苗进行处理。试验设置5个处理,以不施用氮肥的幼苗为对照(CK),氮素处理分别为NH4NO3(N1)、KNO3(N2)、C2H5NO2(N3)和NH4Cl(N4)。浓度配比方法,称取0.0800gNH4NO3、0.1011gKNO3、0.0751gC2H5NO2及0.0535gNH4Cl分别溶于50mL纯水中,氮素浓度均为20mmol·L-1,每处理3次重复。施用方法,取50mL处理溶液(对照用50mL纯水代替)沿幼苗基部周围缓慢倒入育苗盆中。

　　施肥后,15d和30d各取一次样,采用抖根法获取西南蜡梅根系上黏附的土壤作为根际土壤,过筛后用液氮速冻,置于-80℃保存备用。同时,取完整植株样品,编号后待用。

　　表15种氮素形式施肥处理

　　1.4项目测定

　　1.4.1样品理化性质测定

　　土壤样品:采用1∶5土水比法测定pH和电导率;采用2mol·L-1KCl浸提-靛酚蓝比色法测定铵态氮;采用双波长紫外分光光度法测定硝态氮;取5g过筛新鲜土,烘干48h后测定干质量。

　　植株样品:利用直尺测量株高(植株在土壤以上主茎至主茎顶芽基部之间的长度);植株烘干48h后测定干质量。

　　1.4.2土壤DNA提取和PCR扩增

　　用E.Z.N.A.SoilDNAKit(OMEGA,上海)试剂盒提取和纯化土壤总DNA,具体操作参照说明书。PCR反应体系为50μL,包括:模板DNA1μL、10μmol·L-1正反向引物各1μL、ExTaqDNA聚合酶(Takara,大连)25μL、ddH2O22μL。细菌特异性引物序列和反应条件见表2。

　　1.4.3土壤细菌16SrDNA基因的荧光定量PCR

　　采用实时荧光定量PCR仪(LightCycler480Ⅱ,瑞士)进行荧光定量分析,qPCR引物及反应条件见表2。选取含有目的基因片段的质粒,梯度浓度稀释后,进行标准曲线的绘制。质粒和样品qPCR反应体系为20μL:模板DNA1μL、10μmol·L-1正反向引物各0.5μL、TBGreenPremixExTaqⅡ(Takara,大连)10μL、ddH2O8μL。每个样品设3个重复。标准曲线的R2为0.992,扩增效率为96.83%。结合标准曲线,根据Cp值进行细菌拷贝数的计算。

　　表2PCR和qPCR扩增引物及反应条件

　　1.4.4变性梯度凝胶电泳(DGGE)

　　DGGE分析采用D-Code基因突变检测系统(Bio-RadLaboratoriesInc,USA)对扩增后的PCR产物进行分析,凝胶浓度采用8%的聚丙烯酰胺,变性剂梯度为40%～60%(100%变性剂为7mol·L-1尿素和40%的去离子甲酰胺混合物)。每孔上样30μLPCR产物与加样缓冲液的混合溶液,在1×TAE电泳缓冲液中,条件为60℃、50V,电泳12h。电泳后对凝聚进行染色,采用银染方法,图像用数码相机照相。

　　1.5数据分析

　　使用SPSS25.0软件对试验数据进行处理及单因素方差分析和Pearson相关分析;利用QuantityOne软件对DGGE图谱进行数字化处理;利用NCBI的BLAST进行序列同源性比较;利用MVSP3.1软件分析土壤微生物群落多样性Shannon-Wiener指数;使用Canoco4.5.1软件进行冗余分析(RDA)。

　　2、结果与分析

　　2.1不同氮肥对土壤理化性质和植物生长的影响

　　由表3可知,不同氮肥处理对土壤理化性质和植物生长产生不同影响。与对照CK相比,4种氮肥处理后的土壤pH无明显变化,其中N4处理的pH均下降,而N2处理的pH均上升。与15d相比,30d取样的所有处理土壤pH均高于15d取样的对应处理的土壤;土壤电导率均为N4处理最高,N2处理最低;土壤NH+4-N含量均为N3最低,但15d取样时为N4最高,30d取样时为N2最高;土壤NO-3-N含量变化均为N2处理最高,N4处理最低。

　　4种氮肥处理后的植株株高均高于对照CK,且均为N1最高,30d取样时,除N3处理外,其它处理的植株株高均高于15d取样的对应处理植株;氮肥处理后的植株干质量变化趋势一致,大小关系为N1>N2>N3>N4>CK,且30d取样的所有植株干质量均大于15d取样的对应处理植株。

　　2.2不同氮肥对根际土壤细菌丰度的影响

　　由图1可知,荧光定量结果显示不同氮肥处理后的根际土壤细菌数量为3.95×107～6.13×109拷贝数·g-1(干土)。在2个取样时期,除30d取样的N4处理低于CK,其它氮肥处理后的根际土壤细菌拷贝数均高于对照CK,4种氮肥处理后的细菌拷贝数大小关系均为N1>N2>N3>N4,不同处理的细菌拷贝数整体趋势一致,均为先上升后下降。与15d比,30d取样的所有氮肥处理的细菌拷贝数均高于15d取样的对应处理。

　　表3土壤理化性质和植物生长的变化

　　图1细菌基因丰度特征

　　2.3不同氮肥对根际土壤细菌群落结构的影响

　　2.3.1DGGE图谱多样性指数

　　用MVSP3.1软件对DGGE图谱(图2)的数字化处理结果进行土壤细菌多样性指数分析,由表4可知,氮肥处理后的土壤细菌多样性指数均高于对照CK,样品处理15d后,N2处理多样性指数最高,N3处理最低;样品处理30d后,N1处理多样性指数最高,N4处理最低。

　　图2DGGE图谱

　　2.3.2序列分析

　　对DGGE图谱中主要差异条带进行测序,结果用BLAST在GeneBank数据库中进行同源性比较,由表5可知,所测的序列属于细菌γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)为最多,占总数40%,其次环境样品占30%,另外还存在拟杆菌纲(Bacteroidetes)和蓝藻纲(Cyanobacteria)。

　　表4细菌多样性指数

　　2.3.3聚类分析

　　对不同氮肥处理后的根际土壤细菌DGGE图谱进行数字化处理并进行聚类分析,由图3可知,不同氮肥处理整体聚为三大类群。2组对照聚为一大类且相似度达66.67%,说明未进行氮肥处理的土壤,其细菌群落结构比较稳定,无明显变化。30d取样的4个氮肥处理聚为一类且相似度达74.97%,说明氮肥处理时间越长,与第一时期处理相比,细菌群落结构有所差异。

　　表5DGGE条带的序列比对分析

　　图3细菌聚类分析

　　2.3.4冗余分析

　　以不同氮肥处理后的土壤细菌DGGE条带作为响应变量,用土壤的NH+4-N含量、NO-3-N含量、pH、含水量及电导率作为解释变量进行冗余分析(RDA)。由图4可知,含水量、pH和电导率对细菌群落结构的影响较大,而NH+4和NO-3含量对细菌群落结构的影响较小。

　　2.4不同氮肥处理后土壤理化性质、细菌群落结构与植物生长情况的相关性分析

　　对不同氮肥处理后土壤理化性质、土壤细菌拷贝数、多样性指数与植物生长情况进行相关性分析。由表6可知,土壤细菌拷贝数与植物株高和干质量均呈极显著正相关(r=0.566,P<0.01;r=0.653,P<0.01),土壤细菌多样性指数与植物株高和干质量均呈极显著正相关(r=0.502,P<0.01;r=0.668,P<0.01)。pH与细菌拷贝数呈显著正相关(r=0.390,P<0.05),且与细菌多样性指数呈极显著正相关(r=0.527,P<0.01)。

　　3、讨论与结论

　　土壤是植物的生长介质和养分的供应者,其理化性状在一定程度上反映了土壤肥力水平。与未施肥相比,施用铵态氮使根际土壤pH下降,而施用硝态氮使根际土壤pH上升,与乔云发等[18]在水培条件下,研究不同形态氮素对大豆根系形态性状影响得出的结果相似。土壤电导率是衡量土壤盐分的指标,土壤盐分是限制植物生长的重要营养因子之一。结果显示,NH4Cl处理的土壤电导率高于NH4NO3处理且二者均高于对照CK,与油麦菜(LactucasativaL.)土壤上得出的结果相似[19]。施肥30d后的土壤电导率大于15d对应氮肥处理的土壤,与唐颖等[20]在蓝莓(VacciniumSpp)土壤上得出施肥后14d电导率最高的结论不同,其原因可能与植物材料及栽培土壤不同有关。

　　图4土壤细菌与环境因子的冗余分析

　　表6相关性分析

　　试验结果显示,施用氮肥后的西南蜡梅幼苗干质量和株高均高于未施肥的对照CK,4种氮肥中混合氮NH4NO3对植物干质量和株高的促进效果最好,而单一态氮肥中硝态氮优于铵态氮,这与许楠等[9]的桑树幼苗试验结果相似。有研究表明,与单一施用NO-3-N或NH+4-N相比,适当比例的NO-3-N和NH+4-N混合施用有利于维持细胞的电性平衡和pH平衡,对植物的生长发育更为有利[21,22],单独施用NO-3-N容易引起植物根际pH升高,可能会限制植物对其它矿质养分的吸收和利用[23],而单独施用NH+4-N时,可能会影响植物的叶片和根系的生长进而改变植物的正常生长发育[24,25]。

　　土壤总细菌数量是反映土壤总微生物活性的一个重要指标,该试验中根际土壤总细菌16SrDNA基因在107～109拷贝数·g-1(干土),与WANG等[26]研究的玛卡种植红壤的土壤细菌总量数量级一致。施用氮肥后的西南蜡梅幼苗根际细菌数量均高于未施肥的对照,且相比单一态氮,混合氮NH4NO3处理后的土壤根际细菌数量最多,这与张雪等[8]的研究结果相似。结果显示,土壤细菌拷贝数与植物株高和干质量均呈极显著正相关(P<0.01),因此,施肥后根际细菌数量产生差异的原因可能与西南蜡梅幼苗吸收不同氮肥后导致根系生长发育程度不同有关。

　　DGGE图谱分析显示,施用氮肥后的土壤细菌多样性指数均高于未施肥的对照CK,但均未明显改变细菌多样性,与魏天娇等[27]研究的结果相似,其研究结果发现施用氮肥可促进香蕉土壤中氨氧化细菌与古菌的多样性。相关研究证明,在多种生态系统中pH通常与细菌群落结构有很好的相关性[28,29],这与该试验相关性分析得出的结果一致,即pH与细菌拷贝数和多样性指数分别呈显著正相关(P<0.05)和极显著正相关(P<0.01)。同时,该试验结果显示土壤细菌多样性指数与植物生长也呈极显著正相关(P<0.01),因此,细菌多样性的变化可能与氮肥施用后导致土壤pH改变及植物生长状况发生变化有关。对优势DGGE条带进行测序后发现,变形菌占总数40%,为主要类群,与袁红朝等[30]和SHEN等[31]对水稻土和小麦土研究所得出的结果一致。

　　综合分析,结合不同氮肥对西南蜡梅幼苗植株干质量、株高、根际细菌数量及多样性的影响,在所有氮肥处理中,认为NH4NO3最有利于西南蜡梅幼苗植株生长发育和根际土壤细菌的生长繁殖,建议在对西南蜡梅栽植培育时,将铵态氮和硝态氮混合施用,但要确定铵态氮和硝态氮以何种配比施用对西南蜡梅生长发育和土壤微生物群落最有利,还有待于进一步研究。

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