表达透明颤菌血红蛋白对圆红冬孢酵母油脂积累的影响

　　摘要：产油酵母的油脂合成是高度耗氧的生物过程，为提高油脂合成过程中细胞利用氧气的能力，将透明颤菌的血红蛋白基因vgb整合到油脂高产菌株圆红冬孢酵母的染色体中。首先构建了透明颤菌血红蛋白基因vgb表达载体pZPK-PPGK-hyg-TNOS-PGPD-vgb-THSP，再通过农杆菌介导转化的方法将其转化至R.toruloidesNP11中，获得重组菌株。Westernblot和CO差异光谱分析表明，透明颤菌血红蛋白在R.toruloidesNP11中成功表达并且具有生物活性。摇瓶发酵结果表明：与出发菌株相比，在氧气充足条件下，重组菌株NG-21的油脂产量提高了18%;在氧气不足条件下，重组菌株NG-22的油脂产量提高了28%;在限氧和不限氧的条件下，透明颤菌血红蛋白均能够促进圆红冬孢酵母的油脂积累。

　　本文源自可再生能源,2020,38(09):1143-1148.’《可再生能源》杂志，于1983年经国家新闻出版总署批准正式创刊，CN:21-1469/TK，本刊在国内外有广泛的覆盖面，题材新颖，信息量大、时效性强的特点，其中主要栏目有：政策与管理 、研究与实验 、实用技术等。

　　化石燃料的日益耗竭和环境问题的日益凸显，使得人们将目光投向绿色可再生能源。作为生物柴油的原料之一，微生物油脂具有生产周期短、底物来源广泛等优点，因而受到研究者的广泛关注。自然界中，少数微生物可在细胞内合成并储存超过自身细胞干重20%以上的油脂，这些微生物被称为“产油微生物”[1]。圆红冬孢酵母属于红酵母属，其油脂积累可达细胞干重的60%以上，同时，其可以利用的底物较为广泛，木糖、甘油、木质纤维素等廉价的原料均可被其用于油脂发酵[2,3,4]。

　　透明颤菌是一种专性好氧原核生物，其胞内表达的血红蛋白(VHb)使其在贫氧的环境下依然能够生存。透明颤菌血红蛋白与氧气的结合速率远远小于其与氧气的解离速率，因此，透明颤菌能够在胞内储存更多的氧气[5]。胞内储存的氧气可以加速胞内氧化磷酸化的效率;影响细菌胞内的Fnr,OxyR转录因子，从而提高胞内透明质酸、β-葡萄糖苷酶等异源蛋白的表达量;参与胞内的代谢途径，增加胞内代谢物的产量[6,7,8,9,10]。

　　微生物油脂发酵后期，细胞密度增大，导致溶氧量不足，使得细胞生长受到抑制，胞内产物不能正常积累。提高溶氧的传统方法有增加搅拌速率和增大通气量，但是，这两种方法均会增加机械力从而对细胞具有一定损伤。因此，通过基因工程技术来缓解氧气供给不足的情况是一种行之有效的替代方法。XueSJ研究了透明颤菌血红蛋白对菌中普鲁兰产量的影响，研究结果表明，普鲁兰的产量从72.0g/L增加至102.3g/L[11]。ZhangH的研究表明，在溶氧量为30%的3L发酵罐中，与出发菌株相比，表达vgb基因的重组菌株Yarrowialipolytica的生物量增加了27%，油脂含量增加了38.69%[12]。

　　本文尝试通过农杆菌介导转化的方法，将透明颤菌的血红蛋白基因vgb整合至圆红冬孢酵母中，并考察重组菌株在氧气溶量不同的发酵条件下的细胞生长和油脂积累情况，为微生物油脂的工业化生产提供了实验基础。

　　1、材料和方法

　　1.1菌株和质粒

　　本实验所用的菌株和质粒的信息如表1所示。

　　表1所用菌株和质粒

　　1.2工具酶和试剂

　　PrimeSTARDNA聚合酶、rTaqDNA聚合酶、限制性内切酶、DpnI等均购自大连TaKaRa公司;DNAMarker2KplusII购于北京全式金生物技术有限公司;质粒快速提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、PCR产物回收试剂盒和其他生物试剂均购于上海生工生物工程股份有限公司，测序工作委托苏州泓汛公司完成;其他试剂均为分析纯试剂。本研究所用的引物如表2所示。

　　表2本研究所用的引物

　　1.3培养基

　　LB液体培养基：胰蛋白胨10.0g/L、酵母提取物5.0g/L和氯化钠10.0g/L,pH值为7.0。

　　LB固体培养基：在LB液体培养基的基础上加琼脂粉15.0g/L。

　　YPD液体培养基：葡萄糖20.0g/L、酵母提取物10.0g/L和蛋白胨20.0g/L,pH值为6.0。

　　YPD固体培养基：在YPD液体培养基的基础上加琼脂粉15.0g/L。

　　氮源限制培养基(NL培养基)：葡萄糖70g/L、硫酸铵0.1g/L、酵母提取物0.75g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、结晶硫酸镁1.5g/L、体积分数为1%的痕量元素储液(结晶氯化钙4.0g/L、结晶硫酸亚铁0.55g/L、一水合柠檬酸0.52g/L、结晶硫酸锌0.1g/L、结晶硫酸锰0.076g/L和100μL18M的浓硫酸)，pH值为6.0。

　　MM盐溶液：磷酸氢二钾2.05g/L、磷酸二氢钾1.45g/L、氯化钠0.15g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钙0.066g/L、七水硫酸铁0.00248g/L和硫酸铵0.5g/L,pH值为7.0。

　　IM诱导平板：MM盐溶液400mL、甘油5mL、去离子水540mL、琼脂粉20g，高压灭菌后加入40mL1M的MES和最终浓度为200μM的乙酰丁香酮(以上为配置1L时的添加量)。培养微生物的过程中，可根据需求添加适量的抗生素。

　　1.4载体构建

　　设计含有NcoI和SpeI两个酶切位点的引物NcoI-F和Ble-P2A-VHb-R，扩增pUC57-vgb得到NcoI-vgb-SpeI片段;将质粒pZPK-PPGK-hyg-TNOS-PGPD-mcs-THSP与该片段同时进行NcoI和SpeI双位点酶切，再连接;通过化学转化方法将连接产物转至大肠杆菌感受态DH5α，在含有50μg/mL的Kan的LB平板上进行筛选，挑取转化子并测序，获得重组载体pZPK-PPGK-hyg-TNOS-PGPD-vgb-THSP。

　　1.5重组菌株的构建

　　将测序正确的pZPK-PPGK-hyg-TNOS-PGPD-vgbTHSP载体电转化至农杆菌AGL1感受态细胞中，并在含有50μg/mL的Kan的LB平板上筛选转化子。经菌落PCR鉴定，挑取基因型正确的重组农杆菌单克隆转接于5mLLB液体培养基(含50μg/mL的Kan)中。同时，挑取圆红冬孢酵母NP11接种于5mLYPD液体培养基中，两种菌株均在温度为30℃，转速为200r/min的条件下培养16h。取一定量的菌液于1.5mL离心管中，于13000r/min离心30s，收集菌体，用无菌蒸馏水洗涤1次。用无菌蒸馏水将菌稀释至OD600=0.6，分别吸取100μL稀释好的农杆菌和酵母菌等量混合，涂布于IM平板滤纸载面上，并放于24℃培养箱培养2d，将滤纸转至潮霉素抗性浓度为50μg/mL的YPD平板进行重组菌株的筛选，长出转化子后进行遗传稳定性验证及基因型验证。

　　1.6VHb表达及功能验证

　　分别在平板上挑取出发菌株R.toruloidesNP11(简记为NP11)与重组菌R.toruloidesNG-20,R.toruloidesNG-21和R.toruloidesNG-22(分别简记为NG-20,NG-21和NG-22)单菌落转接于50mLYPD液体培养基，在温度为30℃，转速为200r/min的条件下培养24h后，以1∶50的比例转接于50mLYPD培养基中，在温度为30℃，转速为200r/min的条件下培养24h后，离心收集菌体，超纯水洗2次，缓冲液(100mM的磷酸钾溶液，pH值为7.4)洗涤1次，将其重悬于10mL上述缓冲液中至菌体冷却;将Mini型低温高压破碎仪(广州聚能纳米生物科技股份有限公司)的压力调至180MPa，然后将重悬菌体破碎3次，再于4℃，14000r/min离心30min，取2mL上清液测总蛋白浓度。由于透明颤菌血红蛋白能够与CO结合成络合物，在419nm处有特异的吸收峰，因此，使用低温高压破碎仪破碎细胞，再低温离心细胞破碎液并取上清液，进行CO差异光谱分析[13]。向待测蛋白样品中连续通2min的CO，再利用Evolution220型可见分光光度计[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]进行全波长(400～500nm)扫描。

　　1.7摇瓶发酵

　　将出发菌株NP11和重组菌株NG-20,NG-21和NG-22，分别划线于YPD平板，于28℃培养箱培养24h。分别挑单克隆接种于50mLYPD培养基中，在温度为30℃，转速为200r/min的条件下培养24h;再将种子液分别转接至装有50,100mLNL液体培养基的250mL锥形瓶中，初始OD控制为0.1，在温度为30℃，转速为200r/min的条件下发酵至发酵液残糖浓度小于10g/L，收集细胞称取细胞干重，再利用酸热法提取油脂进行后续分析。

　　1.8Westernblot分析

　　取2mL在YPD液体培养基中培养24h的NP11和3种工程菌株，于8000r/min离心5min，弃上清，再用双蒸水清洗一遍;加入200μL细胞裂解液以及适量玻璃珠，利用FastPrep○R-24细胞破碎仪[安诺论(北京)生物技术有限公司]振荡1min(4.0M/s)，冰浴1min，重复5次;取60μL细胞破碎之后的上清液加入20μL4×loadingbuffer,98℃处理10min，取10μL处理过的样品上样(8%分离胶)，15mA限流的条件下进行电泳。通过湿法转膜，将胶上的蛋白转移至硝酸纤维膜上(100mA限流，电泳50min);然后将膜37℃封闭1h，膜清洗液清洗3次，每次5min。一抗采用抗His-Tag单克隆抗体(购于上海碧云天生物技术有限公司)，37℃孵育1h，膜清洗液清洗3次，每次5min;二抗选择山羊抗小鼠IgG抗体(购于上海碧云天生物技术有限公司)，37℃孵育1h，膜清洗液清洗3次，每次5min;添加显色液进行显色，使用Tanon-5200Multi全自动化学发光图像处理系统分析(上海天能科技有限公司)Westernblot结果。

　　1.9细胞显微观察

　　分别取50mL(模拟不限氧条件)和100mL(模拟限氧条件)发酵液发酵终点时的菌液，利用EVOS显微镜(北京东胜创新生物技术有限公司)进行镜鉴，观察出发菌株与工程菌株的细胞形态及胞内油脂积累的情况。

　　2、结果与分析

　　2.1工程菌株vgb基因型验证

　　通过ATMT的方法将vgb整合至圆红冬孢酵母染色体中，使用位于启动子的上游引物GPD-795-F与位于终止子的下游引物Thsp-129-R进行基因型鉴定，结果如图1所示。

　　图1基因型鉴定

　　从图1可以看出，出发菌株NP11无条带，而3种重组菌株NG-20,NG-21和NG-22均具有预期大小的目的条带，这表明透明颤菌血红蛋白基因vgb已成功整合到圆红冬孢酵母染色体上。

　　2.2透明颤菌血红蛋白的表达及活性功能的检测

　　Westernblot和CO差异光谱分析的结果如图2所示。本文使用Westernblot分析VHb蛋白在重组菌株中的表达。从图2(a)中可以看出，在工程菌株泳道中有一条清晰的VHb蛋白(VHb蛋白单体的理论大小为15.7kDa)的免疫杂交条带，说明重组菌株可以正常合成VHb蛋白。VHb在不同的环境条件下可呈现3种不同的状态，若向含酶溶液中鼓入CO气体，则可形成VHb-CO复合物，在419nm处呈现特征吸收峰。为了检测VHb在圆红冬孢酵母中是否具有生物活性，利用CO差异光分析方法进行检测，结果如图2(b)所示[14]。从图2(b)中可以看出，3个重组菌株NG-20,NG-21和NG-22在419nm处均具有吸收峰，而出发菌株NP11没有吸收峰，3个重组菌株间的吸光度有所差别，这可能与VHb蛋白的表达量不同有关。综上可知，透明颤菌血红蛋白在圆红冬孢酵母胞内成功表达并且具有一定的生物活性。

　　图2Westernblot和CO差异光谱分析

　　2.3VHb对油脂积累的影响

　　在本研究中，为了充分验证透明颤菌血红蛋白对圆红冬孢酵母油脂积累的影响，将发酵液的体积分别控制在50mL(模拟不限氧条件)和100mL(模拟限氧条件)，在容量为250mL的摇瓶中进行发酵，结果分别如图3,4所示。

　　图3发酵液的体积为50mL时，VHb对油脂积累的影响

　　图4发酵液体积为100mL时，VHb对油脂积累的影响

　　从图3中可以看出：在不限氧条件下，NG-20的葡萄糖消耗最少，其他重组菌株的葡萄糖消耗无明显差异;出发菌株NP11的油脂产量为8.04g/L，油脂产率为57%,3种工程菌株NG-20,NG-21和NG-22的油脂产量分别为8.31,9.47,8.25g/L，油脂产率分别为59%,61%,58%;与出发菌株相比，NG-21的油脂产量提高了18%。

　　从图4中可以看出：在限氧条件下，发酵至120h之后，3种工程菌株的葡萄糖消耗速率开始快于出发菌株的消耗速率;在发酵终点时，出发菌株的生物量为11.59g/L，而3种工程菌株NG-20,NG-21和NG-22的生物量分别为12.69,11.29,13.38g/L，与出发菌株相比，NG-22的生物量增加了15.40%，这表明透明颤菌血红蛋白能够促进细胞的生长;出发菌株的油脂产量和产率分别为5.78g/L和50%，而3种工程菌株NG-20,NG-21和NG-22的油脂产量分别为7.17,5.77,7.39g/L，油脂产率分别为57%,51%,55%，与出发菌株相比，NG-22的油脂产量提高了28%。

　　2.4VHb对细胞形态的影响

　　在限氧和不限氧条件下，出发菌株和3种工程菌株在发酵终点时的细胞形态如图5所示。

　　图5发酵终点时的细胞形态图

　　从图5(a)可以看出，出发菌株和3种工程菌株的细胞相差不大，但是3种工程菌株的胞内脂滴明显大于出发菌株。从图5(b)可以看出，3种工程菌株的细胞均大于出发菌株的细胞，并且胞内脂滴也明显大于出发菌株。这进一步证明了vgb基因能够提高胞内氧气的利用率并且促进了胞内油脂的积累及细胞生长。

　　3、讨论和结论

　　在大规模发酵生产过程中，细胞密度的增加须消耗更多的氧气，将导致发酵液溶氧量不足。透明颤菌血红蛋白具有运输氧气的功能，本研究在圆红冬孢酵母中表达密码子优化后的vgb基因，发现在限氧和不限氧的发酵水平下，均提高了工程菌株的氧气利用率及耐受贫氧的能力。本文的研究结果表明：在50mL的摇瓶发酵水平(不限氧条件)下，工程菌株NG-21的油脂产量提高了18%;在100mL的摇瓶发酵水平(限氧条件)下，工程菌株NG-22的油脂产量提高了28%。值得注意的是，在氧气不足的情况下，工程菌株油脂产量的提高更为明显，由此说明，透明颤菌血红蛋白可以提高胞内氧气的利用率、缓解贫氧环境下的压力。

　　在限制氧气和不限制氧气条件下，VHb均能够提高圆红冬孢酵母细胞的氧气利用率从而促进油脂的积累，能够缓解因高密度发酵导致氧气不足而造成的细胞死亡及产量下降等问题;同时，降低了机械力对细胞的损害，延长了设备的使用寿命，缩短了发酵时间，在大规模发酵过程中，具有一定的应用前景。

　　参考文献:

　　[7]郝宁,张晋宇,陈国强.在兽疫链球菌中表达vgb基因HA合成基因提高透明质酸产量[J].中国生物工程杂,2005,25(6):56-60.

　　[8]邓发军,潘宇,常飞,等.β-葡萄糖苷酶与透明颤菌血红蛋白在大肠杆菌中的共表达[J].生物工程学报,2018,34(3):379-388.