华癸根瘤菌urtB基因突变株的构建与共生固氮表型分析

　　尿素 ABC 转运体透性酶亚基编码基因 urtB 可能参与尿素代谢及支链氨基酸 转运;本文旨在获得实验证据阐明 urtB 基因对华癸根瘤菌结瘤和固氮的影响，为深入研究 其功能机制提供一定的科学依据。

　　《工业微生物》介绍了工业微生物的特征与分类、微生物的营养与培养基、微生物的生长、微生物的代谢及调控、微生物的遗传变异和育种以及微生物在食品、医药、环保、化工、能源、农业等方面的应用。

　　【方法】利用生物信息学分析 urtB 基因的结构特征及生物 学功能，通过荧光定量检测 urtB 基因在自生和共生条件下的时空表达特征和启动子原位表 达技术检测 urtB 基因组织表达特征，采用插入突变构建 urtB 突变株，通过植物盆栽并结合 添加氮素处理，检测与分析突变体的共生固氮表型变化。【结果】分析表明 urtB 基因对于氮 素转运非常重要，在共生条件下的表达水平比自生培养条件下显著上调表达;在成熟根瘤的 固氮区中大量表达;正确构建和筛选获得了根瘤菌 urtB 突变株;接种 urtB 突变株与野生型 菌株 7653R 相比较，突变体根瘤发育异常;植株地上部分生物量和根瘤固氮酶活性显著降 低;添加氮素可恢复其共生缺陷表型。【结论】华癸中慢生根瘤菌 urtB 基因可能通过影响根 瘤中氮转运或同化，进而在根瘤发育与共生固氮中发挥重要作用。

　　根瘤菌具有多种多样的物质运输系统，能够利用土壤和根际中的各种复合物[1–2]，如运 输氨基酸的ABC转运系统(ABC transporter)等。ABC型尿素转运体是典型的ABC转运系统， 包括 1 个锚定基底物结合蛋白、 2 个整合膜转运亚基和 2 个 ATP 结合蛋白。该系统是由 urtABCDE基因簇编码，其中urtA编码脂质锚定尿素结合蛋白，urtB和urtC编码整合膜蛋白， 由尿素透性酶的2个亚基组成，而urtD和urtE编码ATP结合蛋白[3]。在蓝细菌中，urtA、urtB 和 urtE的突变导致蓝细菌减少尿素的吸收[4]。在缺乏氮素的条件下，ABC转运体才会诱导表达 和合成，尿素的吸收能力提高3倍以上。但是在有氮培养基中，尿素转运会停止或尿素吸 收也被阻碍。根瘤菌是一种能够以类菌体形式存在于豆科植物根瘤中的革兰氏阴性菌，一方 面将氮气固定成植物所需氮源，另一方面利用植物所提供的碳源、氮源生存。有研究报道，

　　在豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)中，编码氨基酸透性酶Aap和Bra基因双突变后，由 于不能利用谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸及天冬氨酸等氨基酸，根瘤菌生长受到明显影响[5]。 另外，在肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)中发现作为ABC转运体的psa透性酶不仅参与 Mn2+转运，同时在系统毒性和抵御超氧化物及过氧化物中发挥重要作用[6]。特别值得关注的 是有研究报道在耻垢分枝杆菌中，在氮饥饿处理条件下，urtB基因上调表达19.17[7]。

　　华癸中慢生根瘤菌为我国特色的固氮资源，具有宿主专一性，其宿主为紫云英[8–9]。 7653R 基因组序列已注释完成，根据本实验室 RNA-sequence 和 Microarray 以及建立的共生 固氮子网络，urtB、urtD 和 urtE 在共生固氮中均上调表达，其中 urtB 基因上调 16.8，其余 分别为 9.4 和 5.1[10]。本研究利用生物信息学分析 UrtB 蛋白的结构特征及生物学功能，通过 荧光定量和启动子原位表达技术检测 urtB 在自生和共生条件下的时空和组织表达特征，采 用插入失活突变技术构建 urtB 突变株，进行植物盆栽实验鉴定其共生表型，以期获得直接 证据阐明 urtB 基因在结瘤和固氮中的重要功能，为深入研究 urtB 基因的功能机制奠定工作 基础和科学思路。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 菌株和质粒：本实验所用供试菌株和质粒见表 1。

　　1.1.2 主要试剂及试剂盒：Ex Taq DNA 聚合酶、dNTPs、2×Taq Master Mix、限制性内切酶、 T4-DNA 连接酶、M-MuLV 反转录酶、RNase 抑制剂购自 Ferments 公司和 TaKaRa 公司，琼 脂糖凝胶电泳 Marker 购自东盛公司，PCR 产物凝胶回收试剂盒购自上海华舜(Watson)生物 公司，抗生素、培养基相关组分等分子生物学常规药品及试剂均购自中国国药集团本。研究 所用 PCR 引物由武汉天一辉远生物科技有限公司合成，DNA 测序工作由天一辉远公司和南 京金斯瑞生物科技有限公司完成。

　　1.1.3 引物：本实验所用引物见表 2。

　　1.2 培养基和培养条件

　　大肠杆菌的培养采用 LB 培养基，在 37 °C 培养。7653R、突变株和定位菌株培养采用

　　TY 培养基，筛选突变株采用 AMS 培养基，在 28 °C 培养。

　　AMS 培养基(g/L)：MOPS 4.19，K2HPO4·3H2O 0.114，NaCl 0.2， MgSO4·7H2O 0.5，加

　　入 1 mL Solution A 和 2 mL Solution B 后，调节 pH 至 7，1´105 Pa 灭菌 30 min。Solution A (g/L)： EDTA-Na2 15，ZnSO4·7H2O 0.16，NaMoO4 0.2，H3BO3 0.25，MnSO4·4H2O 0.2，CuSO4·5H2O

　　0.02，CoCl2·4H2O 0.001，4 °C 长期保存。Solution B：CaCl2·2H2O 1.28 g (定容至 50 mL)， FeSO4·7H2O 0.33 g (定容至 50 mL)，随后混匀为 100 mL，混合溶液现配现用，混合溶液 4 °C 贮存不超过 1 周。Solution C (g/L)：Thiamine hydrochloride 1，D-Pantothenic acid calcium salt Biotin 2，Biotin 0.001，过滤除菌，4 °C 保存。

　　1.3 urtB 突变株、启动子表达定位菌株的构建及筛选

　　1.3.1 重组质粒的构建：以 7653R 菌株基因组 DNA 为模板，urtB-F 和 urtB-R 引物扩增同源 交换臂。PCR 反应条件：95 °C 5 min，55 °C 30 s，72 °C 1 min，30 个循环;72 °C 10 min。 PCR 产物经 DNA 凝胶回收试剂盒回收后连接载体 pMD19-T (Simple)并转化至 DH5α，PCR 验证后将阳性克隆送至南京金斯瑞测序。抽提测序正确的阳性克隆质粒和载体 pK19mob 质

　　粒[11]。以 Hind III、Xba I 双酶切阳性克隆质粒和 pK19mob，回收双酶切后的目的片段、载 体，用 T4-DNA 连接酶连接后转化至 S17-1。PCR 检测阳性克隆并将正确的阳性克隆菌株命 名为 urtB-pK19mob。

　　1.3.2 启动子表达定位菌株的构建：通过网站(http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)预测 urtB 基因启动子序列，PCR 克隆目的片段并连接到 pRG960 载体[12]，将构建好的重组质粒 urtB-pRG960 和空载 pRG960 质粒分别通过电转化到 7653R 感受态中。随后将通过 GUS 染 色筛选得到的阳性菌株，分别命名为 urtB-promoter 和 pRG960-CK。随后分别接种在紫云英 根部。之后分别收取 10、17、25、30 d 的根，经过简单清洗后放到 GUS 染液中，37 °C 染 色 3 h 以上，随后在普通光学显微镜和体式显微镜下观察[13]。

　　GUS 染液：0.01 mol/L K4[Fe(CN)6]，0.5 mol/L EDTA，0.001%Triton X-100，20%甲醇，

　　0.019 mol/L X-Gluc，0.05 mol/L PBS (pH=7.0)。

　　1.3.3 7653R△urtB 单交换突变株的筛选：以 urtB-pK19mob 为供体菌、7653R 为受体菌，进 行两亲本接合转移。将 urtB-pK19mob 导入 7653R，基因通过同源重组交换将质粒整合到染 色体上，从而使靶基因失活。采用含有 Str+Neo 的 AMS 选择性平板上筛选突变体[14]。将筛 选获得的单菌落转移到含有 Str+Neo 抗性的 TY 平板上，以载体 pK19mob 通用引物 M13-F 与酶切位点对应的目的基因筛选引物 D 进行 PCR 检测，同时用野生型 7653R 基因组 DNA 为模板作对照[15]。

　　1.4 植物盆栽实验及共生表型的测定

　　1.4.1 植物盆栽实验：用 75%乙醇清洗紫云英种子表面 5 min，2% (V/V)的 NaClO 溶液表面消 毒 10 min，再用无菌水清洗 8–10 次，彻底洗去 NaClO 残留，消毒后的种子吸水膨胀 4–8 h 后铺于无菌素琼脂平板表面，于 22 °C 培养箱(16 h 光照，8 h 黑暗)中培养约 2–3 d 催芽。催 芽后的种子播种含 Fahareus 无氮植物营养液的无菌沙盆，每组处理 5 株，约 3–5 d 植物幼苗 长出第一片真叶后，在根系接种 1 mL (OD600= 0.5)相对应的根瘤菌悬液，光照培养箱培养 30 d。另外以 Fahareus 无氮植物营养液为基本营养液和 NH4NO3 配制所需营养液的无菌双层沙 盆。

　　1.4.2 共生表型的测定：观察植株长势并测定地上部分鲜重、瘤数、瘤重、固氮酶活(乙炔还 原法)测定[17]。

　　1.5 目标基因在自生和共生条件下的荧光定量表达检测 分别抽提自生条件下培养的华癸中慢生根瘤菌 7653R、接种 7653R 的紫云英 9、12、14、

　　18、21、25、30、45、50 d 根瘤的 RNA，纯化后测定 RNA 浓度，均调至 2000 ng，并进行 反转录。RT-PCR 程序：42 °C 1 h;72 °C 10 min。

　　1.6 荧光定量 PCR

　　先用普通 PCR 将内参基因亮度调一致，然后用目标基因进行扩增，若条带单一，大小 正确，再进行荧光定量 PCR 检测，内参基因为 rnpB。Real-time qPCR 程序：95 °C 5 min; 95 °C 30 s;60 °C 20 s，72 °C 20 s，40 个循环。信号检测染料使用 SYBR Green，分析相对表达量采用 2–△△C

　　1.7 目标基因的生物信息学分析

　　利用 NCBI 网站根据目标基因的 ID 名称查找编码蛋白质的序列及名称，然后通过 NCBI Conserved Domain Search 网页分析靶蛋白的保守结构域，根据保守结构域预测靶蛋白的功 能;将蛋白序列通过 BLASTp 比对查找同源蛋白，挑选不同物种的同源蛋白序列，使用 DNAMAN 软件进行蛋白同源比对分析，使用 Clustal X 和 MEGA7 软件的邻位相接法系统 (bootstrap N-J Tree)来构建系统发育树。

　　2 结果和分析

　　2.1 urtB 基因编码蛋白的结构域和功能分析 基于前期工作基础，我们分析了系列目标基因在共生根瘤中的表达变化，发现 urtB、urtD

　　和 urtE 等在共生固氮条件下均显著上调表达，其中 urtB 上调 16.8 倍，urtD 上调 9.4 倍，urtE 上调 5.1 倍[10–20]。这表明 ABC 型尿素转运体在共生固氮中应该发挥重要功能。urtB 基因全 长 1614 bp，编码 537 个氨基酸，分子量预期大小为 56.6 kDa。我们进一步在 NCBI 上分析 了 urtB 基因编码蛋白的保守结构域(图 1)。

　　通过基本的生物信息分析发现，UrtB 蛋白氨基酸序列包含一个 TM-ABC transporter signature motif 和 urea_trans_UrtB 结构域，含有该结构域的蛋白超家族参与尿素的代谢和循环。蓝细 菌中的研究结果表明该基因缺失造成高亲和力尿素转运的缺失[4]。UrtB 在苜蓿根瘤菌 2011 中的同源基因蛋白是 SMb20604，在苜蓿根瘤中该基因在侵染区、过渡区和固氮区均有表达 其中在侵染区和固氮区的表达量最高。因此，以上分析提示该类基因在根瘤固氮中具有重要 作用。