红肉苹果果实酚类物质含量及抗氧化性测定

　　摘要：以红肉苹果红满堂、红色之爱成熟果实为试材，以红富士为对照，对各品种苹果果皮、果肉中的总酚、总黄酮、总花青素含量以及DPPH自由基清除能力、铁离子还原能力(FRAP)、ABTS+•自由基清除能力进行测定，分析酚类物质含量与抗氧化性的相关性。结果表明，红肉品种红满堂、红色之爱果实中总酚、总黄酮、总花青素含量及其抗氧化性均极显著高于红富士对照，且红满堂极显著高于红色之爱;各品种果皮中总酚、总黄酮、总花青素含量及其抗氧化性均显著高于果肉;酚类物质含量与抗氧化能力之间存在显著相关性。红满堂果实具有高的酚类物质含量与抗氧化能力，可以作为高类黄酮加工型品种进行开发利用。

　　本文源自山西农业科学,2020,48(11):1763-1766+1776.《山西农业科学》(月刊)创刊于1961年，由山西省农业科学院主办。主要刊载生物技术、遗传育种、耕作栽培、生理生化、资源与环境、植物保护、贮藏加工、畜牧兽医等学科的研究报告、学术论文及综合述评等。

　　苹果(MalusdomesticaMill.)是蔷薇科(Rosaceae)苹果属(Malus)植物，属于落叶乔木，在我国已经有2000多年的栽培历史[1]。苹果酸甜清香，不仅含有蛋白质、糖类、有机酸、维生素和微量元素等，还含有多酚、类黄酮等功能性物质。其中，酚酸、黄酮类物质及花青素等是苹果中主要的酚类物质[2]。对蓝靛果[3]、猕猴桃[4]、杏[5]、蓝莓[6]的研究表明，酚类物质具有强的抗氧化功能，有益人类健康[7]。

　　“医食同源”是目前果业的发展方向，“吃营养，吃健康”已经成为人们的共识[8]。红肉苹果(MaluspumilaMill.)是新疆野苹果的一个变种，原产我国新疆伊犁地区以及中亚的哈萨克斯坦等地[9]，具有酚类物质含量高的特点。因此，有效利用新疆野苹果等种质资源，开展远缘杂交育种，进一步培育高类黄酮(红肉与红皮)苹果，对于推动我国苹果产业的优质高效发展及“健康中国”均具有重要意义[10]。

　　本研究以红肉苹果红满堂、红色之爱(RedLove)成熟果实为试材，以红富士为对照，测定3个品种的总酚、总黄酮、总花青素含量以及抗氧化性，并对酚类物质含量与抗氧化性进行相关性分析，旨在筛选出高类黄酮、高抗氧化品种。

　　1、材料和方法

　　1.1 试验材料

　　试验所用苹果品种(图1)为红肉品种红满堂、红色之爱(RedLove)，以白肉品种红富士为对照，均采摘成熟期果实。

　　1.2 试验方法

　　每个苹果品种选取5株长势基本一致、生长发育良好的树，在树冠外围随机采取果实20个。单株小区，5次重复。果实通过清洗、擦干，取薄厚一致的果皮(约1.0mm)及去核果肉，用液氮速冻后冷冻研磨仪粉碎成细粉，称质量分装，存放于-80℃冰箱保存备用。

　　1.2.1 酚类物质的提取

　　参照汪晓谦[11]的方法提取。以70%甲醇内含2%甲酸的混合溶液为提取液。提取时，称取果皮或果肉0.1g，在0℃下加1mL提取液研磨之后再加1mL提取液冲洗研钵，将2次加入的提取液并入离心管。将离心管于25℃、1000r/min条件下振荡30min，之后在10000g下离心10min，取上清液待用。

　　1.2.2 总酚含量的测定

　　总酚含量的测定采用Folin-Ciocalteu法[12]。在离心管中依次加入20μL果实提取液、1.58mL蒸馏水、0.1mLFolin-Ciocalteu试剂(1∶1稀释)，摇匀，充分反应1min后加入饱和Na2CO3溶液1.5mL，避光反应2h。以提取溶剂为对照，用分光光度计在765nm波长下测定吸光度，结果以没食子酸当量(GAE)表示，单位为mg/g。

　　1.2.3 总黄酮含量的测定

　　总黄酮含量的测定采用亚硝酸钠-硝酸铝法[13]。在离心管中依次加入0.5mL果实提取液、0.15mL5%NaNO2溶液，静置6min后加入0.15mL10%Al(NO3)3溶液，静置6min后加入2mL4%NaOH溶液，最后加入2.2mL蒸馏水，振荡混匀静置3min后于508nm下测定吸光度，结果以芦丁当量(RE)表示，单位为mg/g。

　　1.2.4 总花青素含量的测定

　　总花青素含量的测定采用pH示差法。取果实提取液2mL至10mL试管中，分别用pH=1.0(0.2mol/LKCl∶0.2mol/LHCl=25∶67,V/V)、pH=4.5(醋酸-醋酸钠缓冲液：取18g醋酸钠，加冰醋酸9.8mL，再加水稀释至1000mL)的缓冲液定容，反应30min，用紫外分光光度计在510、700nm处测定吸光度，以矢车菊-3-葡萄糖苷表示，利用公式进行花青素含量测定，单位为mg/kg。

　　式中，A为待测液花青素总吸光度;ΔApH1为pH值为1条件下的吸光度差值;ΔApH4.5为pH值为4.5条件下的吸光度差值;A510为待测液花青素在510nm处的吸光度;A700为待测液花青素在700nm处的吸光度;c为待测液花青素质量分数;V为提取液总体积(mL);DF为稀释倍数;M为矢车菊-3-葡萄糖苷的摩尔质量(449.2g/mol);ε为矢车菊-3-葡萄糖苷的消光系数(29600L/(mol·cm));m为样品质量(g);L为光程(1cm)。

　　1.2.5 DPPH法测定抗氧化性

　　DPPH法测定抗氧化活性参照ZHANG等[14]的方法。用无水乙醇溶解DPPH，使溶液的物质的量浓度达到0.1mmol/L，配制完成后置于包裹锡箔纸的烧瓶中，4℃暗保存。测定时取0.1mL待测样品，加入4mL0.1mmol/LDPPH溶液，充分振荡30s，暗反应30min之后，于517nm处测定吸光度。

　　绘制抗坏血酸的自由基清除率相对于其浓度的标准曲线。DPPH抗氧化活性单位为mg/100g。

　　1.2.6 FRAP法测定抗氧化性

　　FRAP法测定抗氧化活性参照ZHANG等[14]的方法。FRAP储备液由300mmol/L乙酸钠缓冲液(3.1gC2H3NaO2·3H2O+16mLC2H4O2,pH=3.6)、10mmol/LTPTZ溶液(溶于40mmol/LHCl)以及20mmol/LFeCl3·6H2O这3种溶液按照10∶1∶1的体积比混合而成，现用现配。测定时，取20μL果实提取液加入1mL水与2mLFRAP储备液，充分混合，于37℃反应10min后，在593nm处测定吸光度。

　　绘制以水溶性维生素E(Trolox)为标样的标准曲线。样品的FRAP抗氧化活性单位为mg/100g。

　　1.2.7 ABTS法测定抗氧化性

　　ABTS法测定抗氧化活性参照AMIR等[15]的方法，略有改动。ABTS+·储备液由5mL7mmol/LABTS溶液和5mL2.45mmol/LK2S2O8溶液混合之后，于室温暗反应12h后制成。测定时用乙醇稀释ABTS+·储备液，于734nm处测得0.70±0.02的吸光度。之后将50μL果实提取液与4mL乙醇稀释后的ABTS+·储备液混合，避光反应6min后于734nm处测定吸光度。样品的ABTS抗氧化性单位为mg/100g。

　　1.3 数据处理与分析

　　试验结果以平均值±标准差表示。使用Origin2018制图，运用SAS8.1软件对所得数据进行显著性差异分析，运用SPSS21软件中Pearson函数对总酚含量、总黄酮含量、总花青素含量与以DPPH法、FRAP法、ABTS法测定的抗氧化性之间的相关性进行计算。

　　2、结果与分析

　　2.1 红肉苹果果实酚类物质含量分析

　　由图2-A可知，红满堂果皮总酚含量最高，为9899.99mg/kg，极显著高于红色之爱(8474.12mg/kg)和红富士(7563.81mg/kg);红满堂果肉总酚含量最高，为4124.74mg/kg，极显著高于红色之爱(3614.01mg/kg)和红富士(2627.64mg/kg)。

　　从图2-B可以看出，红满堂果皮总黄酮含量最高，为39459.77mg/kg，极显著高于红色之爱(25546.51mg/kg)和红富士(21022.64mg/kg);红满堂果肉总黄酮含量最高，为15455.34mg/kg，极显著高于红色之爱(11486.47mg/kg)和红富士(7697.58mg/kg)。

　　从图2-C可以看出，红满堂果皮总花青素含量最高，为499.68mg/kg，极显著高于红色之爱(271.19mg/kg)和红富士(201.67mg/kg);红满堂果肉总花青素含量最高，为135.37mg/kg，极显著高于红色之爱(58.88mg/kg)和红富士(35.98mg/kg)。

　　3个品种总酚、总黄酮、总花青素含量均表现为果皮显著高于果肉。

　　2.2 红肉苹果果实抗氧化性分析

　　由图3-A可知，红满堂果皮DPPH自由基清除能力最强(510.47mg/100g)，极显著高于红色之爱(318.51mg/100g)和红富士(170.59mg/100g);红满堂果肉DPPH自由基清除能力最强(439.04mg/100g)，极显著高于红色之爱(248.37mg/100g)和红富士(71.94mg/100g)。

　　由图3-B可知，红满堂果皮FRAP抗氧化能力最强，为381.39mg/100g，极显著高于红色之爱(303.60mg/100g)和红富士(108.80mg/100g);红满堂果肉FRAP抗氧化能力最强，为238.51mg/100g，极显著高于红色之爱(89.55mg/100g)和红富士(52.65mg/100g)。

　　由图3-C可知，红满堂果皮ABTS+·自由基清除能力最强，为581.61mg/100g，极显著高于红色之爱(515.33mg/100g)和红富士(214.12mg/100g);红满堂果肉ABTS+·自由基清除能力最强，为365.29mg/100g，极显著高于红色之爱(244.51mg/100g)和红富士(143.82mg/100g)。

　　3个品种DPPH自由基清除能力、FRAP抗氧化能力、ABTS+·自由基清除能力都表现为果皮显著高于果肉。

　　2.3 果实酚类物质含量与抗氧化性的相关性分析

　　对果实酚类物质(总酚、总黄酮、总花青素)含量与抗氧化性(DPPH自由基清除能力、FRAP抗氧化能力及ABTS+·自由基清除能力)进行相关性分析，结果如图4所示，果皮中总酚、总黄酮和总花青素含量都与DPPH自由基清除能力呈极显著正相关;果皮中总酚与FRAP抗氧化能力呈显著正相关，总黄酮、总花青素与FRAP抗氧化能力不存在显著相关性;果皮中总酚含量与ABTS+·自由基清除能力呈极显著正相关，总黄酮、总花青素与ABTS+·自由基清除能力呈显著正相关。

　　果肉中总酚、总黄酮、总花青素含量与3个抗氧化指标均呈极显著正相关。

　　3、结论与讨论

　　HU等[16]对苹果果实酚类物质研究表明，苹果属植物在不同组织中，其含量具有显著差异。HOLDERBAUM等[7]对苹果酚类物质分布的研究发现，苹果果皮中总酚含量大于果肉中含量。本研究结果表明，红肉苹果红满堂果实中酚类物质含量极显著高于红色之爱和红富士，且3个品种果皮中酚类物质含量均显著高于果肉中含量，这一结果与前人研究结论一致。

　　本试验对苹果果实DPPH自由基清除能力、FRAP抗氧化(铁离子还原)能力以及ABTS+·自由基清除能力进行分析，结果表明，红肉苹果红满堂、红色之爱果实的DPPH自由基、ABTS+·自由基清除能力、FRAP抗氧化能力极显著高于红富士，且红满堂极显著高于红色之爱。前人研究的结果表明，苹果抗氧化性与苹果酚类物质组成及含量密切相关，酚类物质越丰富，苹果的抗氧化性越强[17]。本研究通过对果实酚类物质(总酚、总黄酮、总花青素)含量与抗氧化性(DPPH自由基清除能力、FRAP抗氧化能力及ABTS+·自由基清除能力)进行相关性分析的结果也支持了此结果。红满堂果实高的酚类物质含量及其高的抗氧化性，说明红满堂可作为加工型高酚类品种进行开发利用。红满堂是以舞美、山定子为亲本杂交选育出的新型红肉品种，其果实自幼果期直至成熟期均为紫红色，果汁呈血红色[18]，果肉不易褐变，可做天然药妆品。本研究进一步为红满堂的开发利用提供了理论支撑。

　　参考文献：

　　[1]冉军舰.苹果多酚的组分鉴定及功能特性研究[D].杨凌:西北农林科技大学,2013.

　　[2]戚向阳,陈维军,杨尔宁.苹果多酚提取物的组成及其抗氧化性能的研究[J].中国粮油学报,2003(5):70-72,79.

　　[3]李雨婷,韩松博,岳子香,等.蓝靛果､枸杞-菊花复合压片糖果制备工艺及抗氧化性测定[J].北方农业学报,2019,47(6):101-107.

　　[4]王华,曹婧,翟丽娟,等.猕猴桃果肉提取物抗氧化活性研究[J].华北农学报,2013,28(2):144-149.

　　[5]李济芳,李芳,金舒宁,等.杏叶总黄酮提取工艺及抗氧化性研究[J].山西农业科学,2017,45(2):258-262.

　　[6]朱晓红,沈佳鑫,马瑞,等.蓝莓叶水提物的体外抗氧化活性[J].山西农业科学,2012,40(8):833-836.

　　[8]刘静轩,曲常志,陈学森,等.新疆红肉苹果杂交二代2个功能型株系果实风味品质的评价[J].果树学报,2017,34(8):988-995.

　　[9]李扬,周语潮,贾林光,等.红肉苹果的研究进展[J].北方园艺,2020(7):146-152.

　　[10]陈学森,王楠,张宗营,等.我国高类黄酮(红皮与红肉)苹果育种取得突破性进展[J].中国果树,2020(2):6-9,22,141.

　　[11]汪晓谦.红肉苹果酚类代谢及其对逆境的响应研究[D].杨凌:西北农林科技大学,2015.

　　[13]黄睿.柑橘类黄酮分光测定法比较及其抗氧化与胰脂肪酶抑制功效评价[D].杭州:浙江大学,2019.

　　[17]张磊.19个苹果属植物酚类物质分析[D].杨凌:西北农林科技大学,2017.

　　[18]杨廷桢,高敬东,王骞,等.苹果属观赏新品种———‘红满堂’的选育[J].果树学报,2015,32(4):727-729.