飞蝗Dpp基因在翅发育中的功能分析

　　摘要：Dpp(Decapentaplegic，Dpp)是脊椎动物和无脊椎动物中非常重要且高度保守的一个信号通路，在细胞的生长和分化等方面具有调控作用。在完全变态昆虫中Dpp调控翅的生长发育，但对渐变态昆虫翅发育的作用机制尚不清楚。本文以飞蝗为研究对象，根据同源性搜索识别飞蝗Dpp基因(LmDpp)，并对其编码的氨基酸序列与不同昆虫Dpp进行多序列比对。然后，利用RT-qPCR方法对LmDpp在五龄飞蝗不同组织及不同发育天数的翅芽进行表达特性分析，结果显示LmDpp在五龄每天的翅芽组织中均有表达，且在多个组织中高表达。利用RNA干扰技术探讨LmDpp在飞蝗翅发育中的作用，结果显示，与对照组相比，注射LmDpp基因的dsRNA(double-strandedRNA，dsRNA)的处理组约有31%的飞蝗在蜕皮后出现翅紊乱表型。苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin，H&E)染色结果表明，沉默LmDpp后的翅新表皮形成异常;RT-qPCR结果显示，沉默LmDpp后导致飞蝗翅特异表皮蛋白基因LmACP7、LmACP8和LmACP19(Adultcuticleprotein，ACP)的表达量显著降低。上述结果表明，LmDpp可能通过调控飞蝗翅特异表皮蛋白基因的表达参与翅的发育与形成，研究结果可为Dpp在渐变态昆虫翅发育中的作用机制研究提供基础。

　　武兆辰; 张福斌; 徐子龙; 张晶; 张建珍; 赵小明， 山西大学学报(自然科学版) 发表时间：2021-09-17

　　关键词：飞蝗;翅发育;Dpp;RNA干扰

　　0引言

　　昆虫是无脊椎动物中唯一有翅的动物。飞行使得昆虫在觅食、繁殖、迁移以及躲避敌害等方面占据很大的优势，这也是昆虫种类和数量繁多的主要原因之一。昆虫翅的生长发育受到多个信号通路以及一系列复杂基因的调控。

　　Decapentaplegic(Dpp)属于转化生长因子β(transforminggrowthfactorβ，TGF-β)超家族，是脊椎动物骨形态发生蛋白(bonemorphogenet⁃icprotein，BMP)的同源物，且在物种间具有保守性。Dpp在昆虫生长发育的多种细胞和分子过程中发挥着多种作用，类似于生长分化因子(growthanddifferentiationfactors，GDFs)、激活素(Activin)和节点素(Nodal)[1]。目前，在黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)中对昆虫Dpp基因功能研究最为深入。在果蝇胚胎发育的早期阶段，Dpp主要参与胚胎间隔的形成和背腹轴的分化[2]。随后，研究发现Dpp与Hedgehog和Wingless信号通路协作，通过Dpp不同浓度梯度的存在，作为一种形态因子，决定了包括翅、足和触角在内的附着物的位置和分化[3-4]。此外，先前研究报道表明，Dpp在卵子发生中起重要作用，并与前端卵壳结构形成模式有关[5]。Dpp还可以通过促进视网膜下胶质细胞的增殖和运动来促进眼睛的发育[6-7]。

　　关于Dpp在昆虫翅发育中的研究同样主要集中在黑腹果蝇，而在其他昆虫中的研究报道较少。例如，在果蝇翅原基发育过程中，Dpp在前后腔室边界中央条纹形成不同的浓度阈值，并以剂量依赖的方式调节下游基因的表达水平[8-9]。随后，Dpp通过控制正在发育的翅中细胞的生长和增殖速率来决定最终的翅大小[9-10]。在果蝇中，Dpp沿翅脉高量表达，其功能的丧失导致脉序的部分缺失或不完全发育[11-12]。与果蝇类似，黄翅菜叶蜂(Athaliaro⁃sae)的Dpp基因在前翅和后翅均有广泛表达，Dpp基因敲除导致翅脉发育完全缺失[13]。此外，Dpp还参与了小地老虎(Agrotisipsilon)翅芽的再生[14]。综上所述，Dpp参与昆虫翅发育进程，在不同物种间其作用具有相似性，但作用方式略有不同。

　　飞蝗(Locustamigratoria)是一种不完全变态昆虫，也是一种重要的作物害虫，主要为害禾本科植物。目前，针对Dpp在昆虫生长发育中的研究，尤其在翅发育中的研究，主要集中在以黑腹果蝇为代表的完全变态昆虫中，然而Dpp在渐变态昆虫翅发育中的作用机制尚不清楚。本文以飞蝗为实验对象，基于飞蝗翅转录组数据库搜索获得Dpp基因cDNA序列，并进行特征分析;通过RT-qPCR技术检测LmDpp基因在5龄飞蝗若虫中的时空表达模式，通过RNA干扰技术结合苏木精-伊红(Hematoxylineosin，H&E)染色分析LmDpp的生物学功能，为Dpp在渐变态昆虫翅发育中的作用机制研究提供基础。

　　1材料与方法

　　1.1实验材料

　　将保存于本实验室昆虫饲养室的飞蝗虫卵置于人工气候箱中孵化，孵化后转移至干净的纱笼中，然后在温度为(30±2)℃，湿度为(40±10)%的饲养室中用新鲜的小麦饲养，到达三龄后添加少许麦麸进行饲养，长至五龄后进行不同组织部位和不同发育天数翅芽取材以及其他实验。

　　1.2实验试剂

　　RNA提取试剂(RNAisoPlus)购于大连宝生物公司(TaKaRa);双链RNA合成试剂盒购于Promega公司;ChamQUniversalSYBRqPCRMasterMix，HiScriptⓇⅢRTSuperMixforqPCR(+gDNAwiper)购于南京诺唯赞生物科技有限公司;胶回收试剂盒购于天根公司(TIAN⁃GEN);其他相关试剂购置于生工生物工程(上海)股份有限公司(SangonBiotech)。

　　1.3实验方法

　　1.3.1飞蝗Dpp基因获取及氨基酸序列比对

　　根据飞蝗翅转录组数据库，以黑腹果蝇Dpp基因(CG9885)cDNA序列进行同源性搜索，获得飞蝗Dpp基因(LmDpp)的cDNA序列。利用Translatetool(https：//web.expasy.org/translate/)将LmDppcDNA序列翻译成氨基酸序列;在NCBI网站对LmDpp序列进行BLAST分析并下载黑腹果蝇、德国小蠊(Blattellager⁃manica)、内达华白蚁(Zootermopsisnevadensis)、亚洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)、棉铃虫(Heli⁃coverpaarmigera)的Dpp氨基酸序列，利用GENEDOC软件进行氨基酸序列比对分析。

　　1.3.2LmDpp表达特性检测

　　摘取五龄若虫飞蝗每一天(第1-8天，N5D1-N5D8)的翅芽(Wingpads，WP)组织，同时挑选发育整齐的五龄第6天的飞蝗，摘取其不同组织，包括足(Leg，LE)、体壁(Integu⁃ment，IN)、翅芽(WP)、脂肪体(Fatbody，FB)、前肠(Foregut，FG)、中肠(Midgut，MG)、后肠(Hindgut，HG)、胃盲囊(Gastriccaeca，GC)、精巢(Testis，TE)和卵巢(Ovary，OV)。利用RNAisoPlus提取不同组织和不同时期样品的总RNA，并稀释到0.5μg/μL。置于-80℃冰箱保存。接着按照反转录试剂盒中的说明书取1μL总RNA进行cDNA的合成。再通过PrimerPremier5.0软件设计LmDpp基因和RPL-32内参基因的特异性荧光定量引物(表1，由上海生工公司合成)，利用RT-qPCR的方法检测LmDpp在不同组织和不同发育时期的表达情况，不同组织和发育时期均设置四个重复试验。最后LmDpp的相对表达量用2-ΔΔCt法进行分析。

　　1.3.3LmDpp基因双链RNA合成及RNA干扰

　　根据LmDpp基因序列设计并合成含有T7启动子序列的RNA干扰(RNAinterference，RNAi)引物(表1，上海生工公司合成)，以五龄飞蝗的cDNA为模板进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测后，通过胶回收回收目的条带，并测定回收产物的浓度。取1μg的胶回收产物为模板进行dsRNA的合成，将合成的dsRNA定量到2μg/μL，接着琼脂糖凝胶电泳检测完整度，置于-20℃保存。选取五龄第1天飞蝗38头，雌雄比例约为1：1，用微量注射器将Lm⁃DppdsRNA(dsLmDpp)注射于飞蝗体腔。每头注射5μL，即10μg。再选取41头飞蝗，注射等量的dsGFP作为对照组。分开饲养，分别喂食新鲜的小麦，饲养至五龄第6天分别取对照组和处理组飞蝗翅芽组织进行总RNA提取、反转录，RT-qPCR方法检测沉默效率。剩余飞蝗继续饲养并进行表型观察。

　　1.3.4H&E染色及翅表皮蛋白基因表达检测

　　根据1.3.3中RNAi结果，重复挑选五龄第1天的飞蝗分别注射dsLmDpp与dsGFP，新鲜小麦饲养，在蜕皮前(N5D7)各取对照组和处理组飞蝗翅芽组织，一部分提取RNA检测沉默效率，另一部分3%戊二醛固定后送到武汉塞维尔生物公司进行石蜡切片和苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosinstaining，H&E)检测。根据课题组前期研究基础，选取沉默效率显著的3组处理组飞蝗，利用RT-qPCR检测LmDpp沉默后对飞蝗翅特异表皮蛋白基因(LmACP7，LmACP8和LmACP19)表达的影响，以RPL32为内参基因，每组设置两个技术重复，检测结果用2-ΔΔCt法进行分析，引物如表1。

　　1.3.5数据分析

　　LmDpp基因在不同发育天数和不同组织中的表达、LmDpp沉默效率以及LmDpp沉默后翅表皮蛋白基因的相对表达量均采用2-ΔΔCt方法进行分析，并采用Studentt-test方法进行差异表达分析(*P<0.05表示差异显著，**P<0.01和***P<0.001表示差异极显著)。

　　2结果与分析

　　2.1LmDpp序列比对分析

　　根据黑腹果蝇Dpp基因cDNA序列进行同源搜索，识别了飞蝗LmDppcDNA序列，该基因编码蛋白含有一个TGFβ_propeptide和TGFβ结构域，多序列比对分析发现TGFβ_propeptide在物种间保守性较低，而TGFβ结构域相似性较高(图1)。

　　2.2LmDpp在五龄不同组织和不同发育时期的表达模式

　　利用RT-qPCR检测LmDpp在五龄飞蝗不同发育天数翅芽组织中的表达，结果显示，Lm⁃Dpp在第1天到第8天都有较高的表达量(N5D1-N5D8);不同组织中的表达结果显示，LmDpp在多个组织中都有表达，如足、体壁、翅芽、脂肪体、前肠、后肠、精巢、卵巢，其中Lm⁃Dpp在足、体壁、前肠中高表达(图2)。

　　2.3LmDpp在飞蝗中的生物学功能分析

　　选取五龄第1天的飞蝗进行dsLmDpp的注射，同时注射等量的dsGFP作为对照。继续饲养至第6天，取飞蝗翅芽提取总RNA，RT-qP⁃CR检测LmDpp的沉默效率。结果显示，与对照组相比，注射dsLmDpp的处理组飞蝗中Lm⁃Dpp表达量极显著下降(图3A)，沉默效率达到77.8%。对飞蝗的表型进行观察，结果显示，对照组飞蝗均能正常蜕皮至成虫，注射dsLmDpp的飞蝗虽能够成功蜕皮但约有31%的成虫出现翅型紊乱的表型，具体表现为前后翅无法正常闭合、皱缩卷曲(图3B)。

　　2.4LmDpp影响飞蝗翅表皮发育

　　为了进一步探讨LmDpp如何影响飞蝗翅发育，在沉默LmDpp表达后，摘取蜕皮前(N5D7)翅芽组织进行石蜡切片和H&E染色分析，以注射dsGFP的飞蝗翅芽为对照。H&E染色结果显示，对照组中蜕皮前翅芽旧表皮发生降解，形成大量新表皮并产生折叠，上下两层新表皮间形成空腔，蜕皮后发育成成虫翅膜和翅脉，而处理组中翅芽旧表皮正常降解，翅新表皮能够折叠但形成异常、无法正常排列形成空腔和正常表皮结构(图4A，B);通过RT-qPCR技术检测飞蝗翅表皮蛋白基因的表达，结果显示，与对照组相比，处理组中LmACP7、LmACP8和LmACP19的表达显著下降(图4C)。

　　3讨论

　　昆虫翅形态的多样性是昆虫种群生长发育的重要原因之一。Dpp信号通路是一个高度保守的信号通路，调节细胞生长和分化等。在完全变态昆虫果蝇中，Dpp在胚胎发育和成虫附肢的形成中起着成形素(morphagen)的作用。如在翅成虫盘中，通过DPP浓度梯度依赖的方式诱导不同基因的区域表达来控制前、后成虫盘的形成[15]。另外，在果蝇背板愈合中线处抑制Dpp信号通路的受体或其信号因子均可以引起严重的背板愈合缺陷现象[16]。近年来，大量研究表明，Dpp基因可以在各种昆虫的翅发育中发挥相同、相似甚至不同的作用，这可能与昆虫发育方式相关。

　　飞蝗是典型的渐变态昆虫，翅在其迁飞、觅食和躲避敌害等方面具有重要作用。本文根据黑腹果蝇Dpp基因编码序列，基于飞蝗翅转录组数据库，通过同源搜索获得飞蝗Dpp基因编码序列。与其他昆虫类似，LmDpp基因编码蛋白含有一个TGFβ_propeptide和TGFβ结构域，其中TGFβ结构域氨基酸序列与完全变态昆虫(如黑腹果蝇、棉铃虫、亚洲玉米螟等)相似性较高(图1)，暗示其功能具有保守性。在渐变态昆虫褐飞虱(Nilaparvatalu⁃gens)翅发育过程中，NlDpp主要负责翅脉的形成，NlDpp的沉默导致长翅型和短翅型褐飞虱前翅和后翅的翅脉完全消失[17]，这种表型与在黄翅菜叶蜂中沉默Dpp的表型相同[13]。在果蝇翅中过表达Dpp导致额外翅脉的发育[18]，而Dpp的缺失导致翅脉的部分丧失[11-12]。上述结果表明，Dpp可能在一定程度上保留了其在昆虫翅脉发育中的功能。昆虫翅由翅脉和翅膜构成，其来源于外胚层，具有表皮结构。在飞蝗中，沉默LmDpp后导致飞蝗翅发育异常，翅表现出卷曲、皱缩的表型(图3)。H&E染色结果显示，沉默LmDpp后飞蝗翅表皮发育异常，新表皮无法正常形成(图4A，B)，表明LmDpp在飞蝗翅表皮形成中具有重要作用。飞蝗五龄若虫新形成的表皮蜕皮后将发育成成虫翅(由翅脉和翅膜构成)，沉默LmDpp影响上下两层新表皮间空腔的正常形成，可能导致成虫翅脉和翅膜无法正常形成，进而导致成虫翅出现皱缩卷曲现象。

　　在褐飞虱中，RNAi介导的NlDpp表达沉默可以显著改变多个翅发育基因的表达[17]，表明在Dpp调控翅形成的过程中，需要多个下游基因协同参与。例如，Dpp信号通路可以调控Spaltmain(Salm)和Spalt-Related(SalR)编码的锌指转录因子控制果蝇翅成虫盘的形成[19]。课题组前期研究发现，表皮蛋白基因LmACP7，LmACP8和LmACP19在飞蝗翅中特异表达[20]，其中LmACP7的表达缺失引起翅表皮细胞排列发生紊乱、细胞连接被破坏，从而引发线粒体途径介导的细胞凋亡[21];而RNA干扰另一个翅表皮蛋白基因LmACP8的表达量，导致飞蝗从若虫到成虫的翅形态发生异常[22]。本文中干扰LmDpp的表达引起LmACP7，LmACP8和LmACP19的表达显著下降(图4C)，结果表明LmDpp可能通过调控飞蝗翅表皮蛋白基因的表达进而控制翅表皮的形成。然而，LmDpp基因如何调控下游靶标基因的表达进而控制翅发育需要进一步研究。本文研究结果为Dpp基因在渐变态昆虫翅发育中的具体作用机制研究提供了基础。