槲皮素对人骨髓瘤细胞U266侵袭和迁移的影响

　　[摘要] 目的 研究槲皮素對骨髓瘤细胞U266侵袭和迁移的影响及机制。

　　方法 用不同浓度的槲皮素处理人骨髓瘤细胞U266，噻唑蓝(MTT)方法测定细胞存活变化，计算其半数抑制浓度。人骨髓瘤细胞U266分为空白对照组(不做药物处理)、阳性对照组(用地西他滨处理)、槲皮素组(半数抑制浓度的槲皮素处理)、PDTC组(NF-κB信号抑制剂PDTC处理)、PDTC+槲皮素组(半数抑制浓度的槲皮素和PDTC处理)共5组进行细胞培养。各组以MTT检测细胞存活能力，划痕愈合实验检测细胞运动能力，Transwell小室检测细胞侵袭和迁移能力，蛋白免疫印迹(Western blot)检测细胞中基质金属蛋白酶2(MMP-2)、核因子-κBp65亚型(NF-κBp65)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)蛋白表达水平。

　　结果 槲皮素组、PDTC组、PDTC+槲皮素组细胞存活、侵袭、迁移能力及细胞中MMP-2、MMP-9、NF-κBp65表达水低于空白对照组(F=28.419～167.394，P<0.001)。PDTC+槲皮素组细胞存活、侵袭、迁移能力及细胞中MMP-2、MMP-9、NF-κBp65表达水平低于槲皮素组和PDTC组(P<0.05)。

　　结论 槲皮素能够通过抑制NF-κB信号通路降低骨髓瘤细胞的侵袭和迁移能力。

　　[关键词] 多发性骨髓瘤;槲皮素;肿瘤侵润;肿瘤转移;NF-κB

　　《中医药文化》创刊后始终以提高中医工作者的古代医学文献阅读和研究能力为办刊宗旨。自1993年第三期始，本刊将学习和研究医古文的着眼点，深深扎根于中华传统文化的沃土之中，以弘扬中医药文化、普及中医药古代文献知识为主，拓展视野。

　　骨髓瘤是一种恶性浆细胞增殖疾病，造血干细胞移植、新型药物的应用等大大提高了骨髓瘤病人的生存期，但是由于骨髓瘤具有易复发、转移快等特点，寻找有效的骨髓瘤治疗方法对病人预后具有重要意义[1]。槲皮素具有抗肿瘤活性，其可以抑制乳癌、卵巢癌、胃癌等肿瘤细胞的生长和转移，但其具体的作用机制尚不明确[2-4]。核因子-κB(NF-κB)是一种在人体内广泛存在的信号转导通路，参与炎症、氧化应激、细胞生长、细胞迁移等多种生理和病理过程，其在恶性肿瘤组织中过度激活，NF-κB抑制剂能够下调肿瘤细胞的恶性表型[5-7]。相关研究显示，槲皮素能够下调肺癌等细胞中NF-κB的激活水平，槲皮素抗肿瘤活性可能与NF-κB信号通路抑制有关[8-9]。有研究结果显示，槲皮素具有抗多发性骨髓瘤细胞生长的作用，槲皮素处理后的NCI-H929细

　　胞株的存活能力降低[10]。因此，本研究探讨了槲皮素对骨髓瘤细胞增殖、迁移及侵袭的影响及其机制，旨在为延长骨髓瘤病人生存期提供参考。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　1.1.1 药品、试剂和细胞 HRP标记的二抗购自北京索莱宝科技有限公司，槲皮素购自大连美仑生物技术有限公司，基质金属蛋白酶-2(MMP-2)抗体购自美国Proteintech，基质金属蛋白酶-9(MMP-9)抗体购自美国Santa Cruz公司，NF-κB信号抑制剂PDTC购自美国Sigma公司，核因子-κBp65亚型(NF-κBp65)抗体购自美国Abbkine，人骨髓瘤细胞U266购自上海江林生物科技有限公司(细胞以含体积分数0.10胎牛血清的RPMI 1640培养液培养。细胞培养参数为：37 ℃，饱和湿度，体积分数0.05 CO2培養箱)。

　　1.1.2 重要仪器 SpectraMax iD3酶标仪购自美国Molecular Devices，TE2000-U倒置显微镜购自日本尼康公司，TGL-18M离心机购自上海卢湘仪离心机仪器有限公司，1658001垂直电泳槽购自美国Bio-Rad。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 噻唑蓝(MTT)检测槲皮素对骨髓瘤细胞存活影响 取生长至对数期的人骨髓瘤细胞U266，以2.5 g/L的胰蛋白酶消化后，接种到96孔培养板中(接种密度为2×107/L，每孔添加100 μL)，放在37 ℃、饱和湿度、体积分数0.05的CO2培养箱中培养过夜。在细胞中添加槲皮素，使槲皮素终浓度分别为0、40、80、160、320 μmol/L，继续培养24 h后，将培养板小心取出，添加20 μL的MTT，置于37 ℃结合4 h，弃上清液。添加二甲基亚砜溶液100 μL，放在振荡器上反应10 min，以酶标仪测定490 nm波长处的光密度(OD)值。经空白孔调零以后，设置0 μmol/L作用组细胞存活率为100%，分析40、80、160、320 μmol/L浓度的槲皮素处理后细胞存活率变化。实验设3个复孔，重复3次。

　　1.2.2 细胞分组 人骨髓瘤细胞U266依次分为：空白对照组(A组)、阳性对照组(B组)、槲皮素组(C组)以及PDTC组(D组)以及PDTC+槲皮素组(E组)共计5组。槲皮素组：采用含有槲皮素终浓度为130 μmol/L的细胞培养液培养;PDTC组：采用含有PDTC终浓度为50 μmol/L的细胞培养液进行培养;PDTC+槲皮素组：采用槲皮素终浓度为130 μmol/L和PDTC终浓度为50 μmol/L的细胞培养液培养;空白对照组：使用不添加槲皮素、地西他滨以及PDTC的细胞培养液培养;阳性对照组：在实验0 h时用3.2 mmol/L的地西他滨细胞培养液培养。以MTT方法检测各组细胞不同培养时间细胞存活率变化，步骤同1.2.1。

　　1.2.3 Transwell小室检测细胞侵袭和迁移能力

　　在Transwell小室中添加RPMI 1640稀释的浓度为100 mg/L的Matrigel，放在37 ℃湿化。取空白对照组、阳性对照组、槲皮素组、PDTC组、PDTC+槲皮素组细胞，用不含血清的培养液悬浮，在Transwell小室的上室内添加105个细胞(200 μL)，分别在下室中添加600 μL的含体积分数0.10胎牛血清的RPMI 1640培养液，放在37℃、体积分数0.05 CO2培养箱中继续培养24 h。将小室取出，用棉签擦掉没有穿膜的细胞。甲醇固定，吉姆萨染色，光镜下选取5个视野观察侵袭细胞数目。Transwell小室细胞迁移实验同侵袭实验，迁移实验前不用Matrigel湿化。实验设3个复孔，重复3次。

　　1.2.4 蛋白免疫印迹(Western blot)检测细胞中MMP-2、MMP-9、NF-κBp65蛋白表达 空白对照组、阳性对照组、槲皮素组、PDTC组、PDTC+槲皮素组细胞按照上述方法培养24 h，用常规方法分别提取细胞中的总蛋白，蛋白样品保存在-80 ℃。SDS-PAGE电泳后在冰上转膜70 min。将电转后的NC膜取出，置于含体积分数0.05牛血清清蛋白的封闭液中孵育结合2.0 h。NC膜再与MMP-2、MMP-9、NF-κBp65抗体稀释液在4 ℃过夜反应以后，与HRP标记的二抗反应2.0 h，以ECL发光试剂盒发光。用Quantity One软件扫描分析MMP-2、MMP-9、NF-κBp65条带和内参β-actin条带的灰度值，分析目的条带表达水平。MMP-2、MMP-9、NF-κBp65抗体分别以1∶600、1∶600、1∶400稀释，HRP标记的二抗以1∶4 000稀释。