基于高通量测序技术的中温大曲中微生物群落多样性解析

　　摘要：采用高通量测序技术对河南省某酒企中温大曲曲皮和曲心两个部位的真菌群落和细菌群落的多样性及其组成进行了研究.结果表明：1)中温大曲曲皮样品中真菌群落多样性和丰度均高于曲心样品;子囊菌门是大曲曲皮和曲心样品中的唯一优势菌门;大曲样品中共检测到15种真菌，其中扣囊复膜孢酵母、雪黄散囊菌和毕赤酵母sp1为曲皮和曲心样品中的优势真菌，扣囊复膜孢酵母在曲皮和曲心样品中的含量基本一致，而雪黄散囊菌和毕赤酵母sp1在曲皮和曲心样品中的含量差异较大.2)中温大曲曲心样品中细菌群落多样性高于曲皮样品，但其丰度低于曲皮样品;在大曲样品中共检测到28个属，其中肠杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、布氏杆菌属、肠球菌属和欧文氏菌属为大曲样品中的优势细菌属，除布氏杆菌属外，其他优势细菌属在曲皮和曲心样品中的含量差异较大.

　　關键词：白酒;中温大曲;微生物群落;高通量测序技术

　　《微生物学通报》主要刊登微生物学、生物工程、病毒学、酶工程、发酵工程、细胞工程等领域的最新研究成果，产业化新技术和新进展。

　　0 引言

　　曲作为一种糖化剂、发酵剂、产香剂和原料，在制酒、制醋、制酱油等传统酿造行业的应用已有几千年的历史.其中，大曲主要用于白酒固态发酵[1]，其品质的优劣在很大程度上决定了白酒的品质和风格.大曲主要是以大麦、小麦、豌豆等单一或多种谷物为原料，经破碎、加水混合再压成块状曲醅[2]，经自然或人工接种并在适宜的温度和湿度条件下进行固态发酵，经成型、控温、贮存等十几个环节而制成块曲或砖曲.制曲过程中，纯种或环境中的微生物在适宜的条件下经过长时间的富集和培养，可在曲醅表面和内部形成有益的酿酒微生物群系[3].大曲微生物菌群复杂，主要集中在酵母菌、霉菌和细菌三类菌中，三者在酿酒过程中的糖化、产香、产酒方面可以协同作用，但各自侧重不同[4]：酵母菌有酒化和酯化的作用;霉菌助产一些生物酶，如红曲霉和米根霉产酯化酶，黑曲霉助产淀粉酶、蛋白酶和糖化酶[5-6];细菌助产一些呈香物质，如吡嗪类化合物、愈创木酚、苯甲醛、乳酸、芳香族化合物等多种香气成分.此外，大曲中还有少量的放线菌，其功能虽然尚不明确，但其可以产生蛋白酶，使蛋白质分解成氨基酸，进而与淀粉分解生成的糖反应会产生醛、酮、吡嗪类化合物等香味物质.

　　目前，关于大曲群落信息研究的报道很多[7-8]，其所采用的方法包括传统可培养方法[9]、传统分子生态学方法(16s rDNA克隆文库法[10]、PCR|DGGE[11]，扩增核糖体DNA限制性分析[12]和PLFA[13]等)和高通量测序技术[14].尤其是高通量测序技术的应用，使得大曲中痕量微生物和不可培养微生物得以被发现，极大地丰富了人们对大曲中微生物群落多样性的认识.目前对产自四川、贵州等地区的大曲微生物的研究较多，但对产自河南地区的大曲微生物群落的研究相对较少，且对产自河南地区的大曲曲皮和曲心微生物群落差异尚不明晰.基于此，本文拟采用高通量测序技术研究河南地区中温大曲曲皮和曲心两个部位的微生物群落多样性及其组成，以期拓展对河南地区中高温大曲中微生物种类的研究，在一定程度上丰富对我国不同地区中温大曲微生物多样性的认识.

　　1 材料与方法

　　1.1 材料和仪器

　　1.1.1 样品采集 中温大曲样品，取自河南某知名酒厂，取曲块表面厚度约为1 cm的大曲作为曲皮样品，粉碎后备用; 在曲块中心，取长、宽、厚均为5 cm的正方体作为曲心样品，粉碎后备用.

　　1.1.2 主要试剂 2×Taq PCR MasterMix，上海天根生物公司产;引物ITS1/ITS4和515F/806R，

　　氯化钠、苯酚、氯仿，生工生物上海股份有限公司产;无水乙醇，上海联硕生物技术有限公司产;Triton X-100，上海碧云天生物技术有限公司产;SDS，美国Amresco公司产;Tris，北京索莱宝科技有限公司产;EDTA，上海国药集团化学试剂有限公司产;醋酸铵，天津市科密欧化学试剂有限公司产.以上试剂均为分析纯.

　　1.1.3 主要仪器 MP200A型精密电子天平，上海良丰仪器仪表有限公司产; TG16-WS型台式高速离心机，安徽中佳科学仪器有限公司产;DKY-Ⅱ型恒温调速回转式摇床，倍辉北京产品部产;ZDX-35B型灭菌锅，上海三申医疗器械厂产;SW-CJ-1F型超净工作台，苏州净化设备有限公司产;JY92-Ⅲ型PCR仪，宁波新芝生物科技股份有限公司产;DYY-8C型琼脂糖电泳仪，北京市六一仪器厂产.

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 基因组提取

　　1.2.1.1 样品预处理 分别称取7 g大曲曲皮和曲心样品，用20 mL灭菌后的0.1 mol/L PBS缓冲液悬浮，加入3—5颗玻璃珠，漩涡振荡5 min后在300 r/min转速下离心5 min，取上清液，沉淀用PBS缓冲液重复洗涤3次，离心后合并上清液.将上清液于9000 r/min转速下离心3 min，弃去上清液，收集细胞沉淀.再用 5 mLPBS缓冲液重复洗涤3次，每次于9000 r/min转速下离心3 min，收集细胞沉淀.最后将细胞沉淀用1.5 mL PBS缓冲液重新悬浮，该悬浮液用于基因组提取.

　　1.2.1.2 DNA的提取 上述悬浮液中DNA的提取参照H.Y.Wang等[15]的方法.

　　1.2.2 PCR扩增与高通量测序 采用原核微生物16S rRNA基因序列V4可变区设计的通用引物515F/806R[16]和真核生物通用引物ITS1/ITS4分别对上述基因组进行PCR扩增，两种引物的PCR扩增和高通量测序方法分别参照胡晓龙[17]和朱文優[18]的方法进行.

　　1.2.3 数据处理

　　1.2.3.1 序列质量控制 采用Cutadapt(v1.9.1)，Vsearch(1.9.6)，Qiime(1.9.1)分析软件对所测原始序列进行质量控制：首先，将每对双向测序的序列进行比对，根据比对的末端重叠区进行拼接，拼接时保证至少有20 bp的重叠区，去除拼接结果中含有N的序列;接着，去除引物和接头序列，去除两端质量值低于 20 bp的碱基，去除长度小于200 bp的序列;最后，将上面拼接过滤后的序列与数据库进行比对，去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效数据.

　　1.2.3.2 操作分类单元(OTU)分析 采用Qiime′s uclust程序将相似度为97%的有效序列归为一个OTU，并确定每个OTU的代表序列[17].将获得的每个OTU的代表序列与RibosomalDatabase Project(RDP)在线数据库进行比对，选取置信度为80%的阈值对上述序列进行分类，进而确定每个OTU的分类水平，即门、纲、目、科、属、种水平.

　　2 结果与讨论

　　2.1 大曲样品中真菌群落多样性及其组成分析

　　2.1.1 大曲真菌群落多样性

　　大曲真菌群落稀疏曲线如图1所示.由图1可知，当测序深度超过10 000序列时，曲皮和曲心样品中真菌群落Observed OTU数目基本不再增加，稀疏曲线趋于平缓.由于本实验所测序列深度远高于10 000条，因此，本文所选取样品有效测序数量能够较全面地反映待测大曲样品的真菌群落多样性信息.

　　大曲真菌群落多样性指数见表1.由表1可知，经过Illumina Miseq高通量测序和序列质量控制，曲皮和曲心样品中真菌菌群中所得有效序列分别为66 850条和 70 954条.曲皮样品中真菌群落的Shannon和 Chao1指数均略高于曲心样品，表明曲皮样品中真菌群落多样性和丰度高于曲心样品.这可能是由于在制曲和存放过程中曲皮和空气或地面直接接触，氧气充足，而曲心温度高于曲皮且氧含量低于曲皮，进而导致曲皮真菌群落多样性和丰度高于曲心，这与李燕荣等[19]的研究结果一致.

　　2.1.2 大曲真菌群落组成 大曲曲皮和曲心样品中真菌群落组成如图2所示.由图2可知，代表性OTU序列的物种注释结果表明，除“门”水平外，大曲曲皮和曲心样品在不同分类水平上存在一定的差异.

　　在“门”水平(图2a))，子囊菌门(Ascomycota)是曲皮和曲心样品中的唯一优势(相对含量≥1%)菌门，相对含量均大于99%，同时也是四川和安徽等地区中温大曲中的优势真菌菌门[18，20].

　　在“纲”水平(图2b))，酵母纲(Saccharomycetes)和散囊菌纲(Eurotiomycetes)为大曲样品中的优势真菌，且其中酵母纲的相对含量远高于散囊菌纲的相对含量;较之于曲心，曲皮样品中酵母纲相对含量较高，散囊菌纲相对含量较低.

　　在“目”水平(图2c))，酵母菌目(Saccharomycetales)和散囊菌目(Eurotiales)为大曲样品中的优势微生物，同时也含有少量的毛霉目(Mucorales).

　　在“科”水平(图2d))，共检测到9个科，其中复膜孢酵母科(Saccharomycopsidaceae)、发菌科(Trichocomaceae)、毕赤酵母科(Pichiaceae)和酵母科(Saccharomycetaceae)为大曲样品中的优势菌科，其在曲皮和曲心样品中的平均相对含量分别为65.3%，27.2%，3.5%和2.2%.较之于曲心样品，曲皮中毕赤酵母科(6.3%)和酵母科(4.1%)的相对含量较高;复膜孢酵母科在曲皮(65.4%)和曲心(65.2%)中的相对含量差别不大;发菌科(23.3%)的相对含量较低.