密闭系统下鲜切猕猴桃呼吸代谢特性研究

　　摘要：目的 探究鲜切猕猴桃的呼吸代谢特性，为气调包装的设计及鲜切猕猴桃货架期的预测提供参考。方法 以“海沃德”猕猴桃为试材，采用密闭系统法，对鲜切猕猴桃贮藏过程中密闭系统中的气体体积、乙醇含量及相关品质指标进行测定。结果 随着贮藏时间的增加，密封系统内逐渐进入低氧状态;对鲜切猕猴桃的呼吸速率进行拟合，其拟合度较高;基于 Michaelis-Menten 方程建立了鲜切猕猴桃的酶动力学呼吸模型，该方程的决定系数(R 2)在 0.9 以上，最大呼吸速率为 6.36 mL O2/(kg • h)和 6.53 mL CO2/(kg • h);果实的乙醇含量在 144 h 后骤然上升，这可能是鲜切水果密闭包装条件下的发酵阈值点。结论 鲜切猕猴桃的呼吸代谢过程符合一级动力学特性，米氏模型的拟合度较高。本研究中鲜切猕猴桃于 144h 后进入无氧呼吸状态，可为 MAP 的设计及鲜切猕猴桃货架期的预测提供参考。

　　本文源自王云香; 李文生; 孟燕华; 周家华; 常虹; 王宝刚， 包装工程 发表时间：2021-06-23

　　关键词：猕猴桃;呼吸速率;发酵阈值;品质;密闭系统

　　鲜切水果又被称为轻加工水果，是在保持水果产品生鲜状态、保留产品原有的风味和营养成分的基础上，最少加工的水果产品。鲜切水果具有快捷、方便、卫生等特点，国内的需求量也是越来越大，存在着具大的商业潜力[1-3]。猕猴桃是公认的“Vc 之王”，果实中的 Vc 含量很高，且其果实鲜香多汁，酸甜适口，受到消费者的广泛喜爱。鲜切猕猴桃也成为鲜切水果中不可或缺的产品。但由于猕猴桃鲜切加工后呼吸作用强烈，易失水、软化或腐烂，导致产品的货架期短，保鲜难度大[4]。

　　国内外针对鲜切水果的保鲜技术已开展了较多研究，例如气调保鲜[5]、臭氧处理[6]、涂膜保鲜[7,8]、冷等离子[9]处理等。其中，气调包装(modified atmosphere packaging,简称 MAP)技术在果蔬保鲜方面取得较好效果。在气调包装系统中，包装薄膜的透气性与果蔬的呼吸作用会形成平衡，使包装的内环境中氧气体积分数低而二氧化碳体积分数高，从而抑制了果蔬的呼吸和生理代谢作用，从而延长果蔬贮藏时间的一种包装技术[10]。气调包装的设计与包装产品自身的呼吸速率、贮藏环境的温度和相对湿度等因素有关。对于恒定温湿度条件下，果实呼吸速率模型的建立对于气调包装的设计非常重要[11-12]。因此，本研究拟通过研究鲜切猕猴桃在密闭系统中的呼吸速率变化规律，建立呼吸代谢的模型，预测其发酵阈值，为鲜切猕猴桃的货架期预测提供理论依据。

　　1 材料方法

　　1.1 材料与设备

　　供试原料为“海沃德”猕猴桃，产地陕西，购自北京新发地农产品批发市场。挑选成熟度一致(硬度约为 7.8 kg/cm2)，果形基本一致，果面完好，无机械伤、无病害、洁净的果实经预冷至 4℃后备用。

　　乙醇标品，色谱级，纯度为 99.9%，购买自美国 Sigma-Aldrich 公司。 O2/CO2气体分析仪(CheckMate II 型)，FT-02 型硬度计(探头直径 6 mm)，PAL-1 型折光仪，794 型电位滴定仪，Waters 2695 液相色谱仪。

　　1.2 样品制备

　　将猕猴桃果实浸泡于 200 mg/L 次氯酸钠溶液中消毒 2 min，取出后清水漂洗 3 次，去皮、切片(厚度 10 mm)，然后装入密闭系统中，密封，贮藏于冷库中(4±0.5℃)。每盒样品约 0.4 kg，初始时密封系统中气体条件为大气状态(21℅ O2、0.03℅ CO2)。试验重复三次。

　　1.3 密闭系统的设计

　　本研究所使用的密闭系统如图 1 所示。根据实验样品体积选择适宜大小、密封性良好的乐扣保鲜盒(聚丙烯，PP 材质)，然后在盒盖上打孔，安装硅胶管用于气体取样与循环。试验前进行了密闭性测试，密封盒密闭性良好。用排水法测得此密闭系统的体积为 1.2 L，产品占用体积约 0.8 L，自由体积约 0.4 L。

　　1.4 测定项目

　　1.4.1 品质指标

　　果实硬度和可溶性固形物含量分别采用硬度计 (FT-02, Facchini, Italy, 探头直径 6 mm) 和糖度计 (PAL-1, Atago, Japan)进行测定[13];果实可滴定酸含量的测定用电位滴定仪进行 [14];Vc 含量的测定采用高效液相色谱法 [15]。在原料品质指标测定时，硬度和可溶性固形物取 10 个果进行测定，平行 10 次;可滴定酸和 Vc 含量测定将 10 个果混合，重复 3 次。在鲜切猕猴桃贮藏过程中，可溶性固形物取 10 片果进行测定，平行 10 次;可滴定酸和 Vc 含量测定将 10 片果混合，重复 3 次。单果重采用天平(TE601-L 电子天平，德国赛多利斯公司)进行测定;果实横径、纵径及厚度采用游标卡尺(Santo，上海赛拓五金工具有限公司)。

　　1.4.2 气体体积变化及呼吸速率

　　利用密闭系统法对包装内气体体积及果实呼吸速率的变化进行测定。具体操作为将密封盒放置于冷库恒定的温度条件下(4℃)密闭一定时间后，抽取密封盒中顶空气体，测量氧气和二氧化碳的浓度，并通过下列方程计算果实的呼吸速率[16,17]：      f i i f O M t t O t O t V R    100 2 2 2 (1)       f i f i CO M t t CO t CO t V R    100 2 2 2 (2) 式中：RO2 和 RCO2 分别代表氧气消耗和二氧化碳生成的速率，mL/(kg·h);[O2]ti 和 [O2]tf 分别代表测量的起始和终止时氧气的体积分数，%;[CO2]ti 和[CO2]tf 分别代表测量的起始和终止时二氧化碳的体积分数，%;ti和 tf分别代表测量的起始和终止时间，h; V 是密封盒的自由体积，mL;M 是样品的质量，kg。

　　1.4.3 呼吸商

　　呼吸商(RQ)也称作呼吸系数，呼吸商越大，果实吸入氧气的量就越小，氧化时释放出的能量就越少[8]。若果实的呼吸商值发生了变化，则表明呼吸代谢消耗的底物比例发生了变化。通常认为，当 RQ 的值大于 1.3 时果蔬则产生了厌氧呼吸。呼吸商的计算公式如下所示[12]： 2 2 / CO O RQ  R R (3)

　　1.4.4 阈值

　　引发鲜果厌氧呼吸的 CO2 和 O2 气体浓度临界值通常被称为发酵阈值[7]。在密闭系统中，CO2 和 O2 的气体浓度存在一定的相关性，可以进行拟合得到线性方程。根据 RQ 值(大于 1.3)及得到的线性方程，结合实际测量数据代入方程后确认阈值[18]。拟合线性方程 y=ax+b (4) 式中：a、b 为方程常数;本研究中 y 指 CO2体积分数，x 指 O2体积分数。

　　1.4.5 酶动力学模型

　　酶动力学模型是一种常见的呼吸速率模型，研究证明作为的无竞争型抑制形式与大部分果蔬的呼吸机制类似，并以此公式来建立的模型得到了广泛的应用。其方程如下[16]：      2 2 2 K 1 CO / K O V O R m i m   (5) 式中： R 代表着 果 蔬 的 呼吸速率， mL/(kg·h) ; Vm 是果蔬的 最 大 呼 吸 速 率 ， mL/(kg·h);[O2]和[CO2]分别是产品包装内部某一时刻 O2和 CO2的体积分数，%; Km是米氏常数，%;Ki是 CO2的非竞争抑制系数，%。式(5)化作线性形式如下：   2 2 1 1 1 1 CO V O K V K R V m i m m m    (6) 根据试验测定得到的 O2和 CO2体积分数以及计算得到对应的 O2消耗和 CO2生成的速率，利用 spssau 线上平台分析，得到果实的呼吸方程参数。

　　1.4.6 乙醇含量测定

　　鲜切产品的乙醇含量测定参考侯玉茹等[19]所用方法。称取样品 20.0 g，在 10 mL 的超纯水中进行研磨，随即转入 100 mL 的容量瓶中进行定容，然后提取 10 min，之后先用滤纸过滤后再过 0.45 μm 滤膜，滤液当即使用液相色谱进样测定。

　　液相色谱使用的色谱柱为 DB-WAX(60 m×0.25 mm×0.25 μm)毛细管柱 。色谱柱的温度使用的是程序升温的方法，柱温首先在 40 ℃的条件下保持 11 min，之后以 20 ℃/min 的速率升至 220 ℃，保持 13 min。进样口的温度设置为 230 ℃，使用的检测器为 FID，温度设置为 300 ℃。采用氮气作为载气，柱流量为 2 mL/min，进样量是 1 μL，分流比是 20:1。

　　2 结果与分析

　　2.1 基础指标

　　在本次试验中，猕猴桃基础指标如表 1 所示。其单果重量大于 132 g，果实纵径大于 50 mm，可溶性固形物含量大于 11%，可滴定酸含量小于 0.8%。

　　2.2 贮藏期间气体含量变化

　　由图 2 可以看出，随着贮藏时间的增加，鲜切猕猴桃密封系统中 O2所占的体积分数呈降低趋势，CO2 的体积分数则表现为升高趋势，O2 体积分数变化曲线与 CO2 体积分数变化曲线会在某点相交，这是典型的密闭系统中 O2和 CO2体积分数的变化规律。之前有研究表明，温度越高，密封盒内产品的呼吸代谢强度越高，密切系统中 O2和 CO2的体积分数变化速度越快，两条变化曲线则越早相交[12]。在本研究中，随着贮藏时间的增加，O2和 CO2的体积分数变化曲线在 96 h 相交，此时 O2和 CO2的体积分数分别为 8.80%和 9.43%，与初始的气体成分相比，O2 含量降低了 12.2%，CO2 增加了 9.4%。在贮藏结束(156 h)时，O2 和 CO2的体积分数分别为 7.20%和 10.79%。

　　2.3 贮藏期间呼吸速率变化

　　由图 3 可见，鲜切猕猴桃果实的呼吸速率在贮藏初期是最高的。贮藏过程当中，多半时间段 Ro2高于 Rco2。在 72 h 首次出现呼吸速率的回升高峰，在 108 h 时和 150 h 出现第二次和第三次，在这三个时间点 Rco2明显升高。并且，在 72 h 和 150 h RCO2高于 Ro2 。在贮藏过程中，在 120 h 时出现了呼吸速率的最低值，果实的呼吸强度接近于 0。对于贮藏期间呼吸速率降低过程中出现回升，呼吸速率折线图起伏，与高萌[20]的结果相一致。对此现象仍未有较为合理的解释，有待进一步深入的研究。但是，从整体看，随着贮藏时间的不断增加，密封环境中果实的呼吸强度整体呈不断下降趋势，且多数时间段 Ro2 高于 Rco2。出现该现象主要是因为密闭系统法的测定在封闭的容器中进行，O2 浓度不断下降，而 CO2 浓度不断上升，果实呼吸强度会受到低氧环境的影响而减弱，也可以说果实的呼吸得到抑制。这种情况与前人研究中果实在密闭环境中的前高后低的呼吸速率变化规律是一致的[21- 23]。

　　2.4 呼吸商和阈值

　　鲜切猕猴桃呼吸商的变化如图 5 所示，其值在 0.7~1.3 之间波动。根据公式(3)计算在贮藏时间是 150 h 的时候 RQ 大于 1.3，此时的气体含量为 O2 7.6%和 CO2 10.66%。根据 1.4.4 中发酵阈值的计算方法，建立了密封盒内 O2 浓度和 CO2 浓度的线性关系，其相关系数 R 2 为 0.995，同时拟合得到了两者的一次线性方程的如图 4 所示，结合呼吸商出现时的气体体积分数，分别将 150 h 与前后两个时间点的气体分数代入计算，根据计算结果，得到了阈值为 144 h O2 8.11%和 CO2 9.99%。根据呼吸商与呼吸阈值的结果，表明鲜切猕猴桃对低温低氧环境有一定耐受性，可以延缓厌氧呼吸的发生，在荔枝[22]、草莓[12]等水果的研究中也得出相似的结果。

　　2.5 酶动力学模型

　　米氏模型参数的计算是采用在线分析软件 spssau 进行的。模型得到的各参数值如表 2 所示。两组参数决定系数(R 2)均大于 0.9，表明该模型的拟合度较高。其中 Vm 表示果实的最大呼吸速率，最大 RO2是 6.36 mL /(kg • h)，最大 RCO2是 6.53 mL /(kg • h)。Km和 Ki是方程的常数，将其代入模型的方程中，得到鲜切猕猴桃果实的呼吸模型如下。根据该模型可以预测鲜切猕猴桃的呼吸速率。

　　2.6 贮藏期间乙醇含量的变化

　　果实进入无氧呼吸之后，会产生乙醇等无氧代谢产物，因此，果实中乙醇含量可以作为判断是否产生无氧呼吸的主要依据[24,25]。我们测定了鲜切猕猴桃贮藏过程中乙醇含量的变化。如图 6 所示，在贮藏的初始阶段，乙醇含量较低，仅有 36.52 mg/kg。且在有氧呼吸阶段，乙醇含量处于相对稳定状态。在达到发酵阈值 144 h，即进入无氧呼吸阶段时乙醇含量骤然升高。最高时的乙醇含量为 285.08 mg/kg。

　　2.7 品质指标

　　果实在采收后的贮藏过程中生理代谢仍在进行。在此过程中，果实中的一些营养成分会作为“呼吸基质”而被消耗。如表 3 所示，在贮藏的起始(0 h)猕猴桃果实中的可滴定酸含量最高，随着贮藏时间的增加其含量呈现出了降低的趋势;可溶性固形物含量呈现出缓慢升高的趋势;而 Vc 含量最高时可达到 49.4 mg/100g，达到发酵阈值 144 h 后，Vc 含量开始下降。根据各项指标数据我们计算出，初始状态与贮藏结束相比，可溶性固形物含量升高了 13%，可滴定酸含量降低了 11%，Vc 含量下降了 18%。

　　3 结语

　　离体的果蔬其细胞内仍进行着旺盛的呼吸代谢，在一定程度上呼吸越旺盛其保鲜期越短。果蔬气调包装借助果蔬自认呼吸与包装材料的透气性的相互作用形成能抑制果蔬呼吸的气体环境，从而延长果蔬保鲜期[10]。因此，建立果蔬呼吸速率预测模型是气调包装设计的关键技术之一[11-12]。酶动力学呼吸模型是一种常见的呼吸速率预测模型，以此公式来建立的模型得到了广泛的应用[16]。该方法是将测定得到的 O2 和 CO2 体积分数以及计算得到的对应 O2消耗和 CO2生成速率代入模型，求得果实的呼吸方程参数。在本研究中，在密闭系统低温贮藏条件下，由于贮藏环境中氧气含量减少、二氧化碳含量升高，鲜切猕猴桃呼吸速率整体呈逐渐降低趋势，这与前人研究中果实在密闭环境中的呼吸速率变化规律是一致的[21-23]。。将试验得到的参数代入模型，发现鲜切猕猴桃果实呼吸代谢过程符合一级动力学特性，模型中参数的 R 2 均大于 0.9，表明模型拟合度较高，能较好预测其呼吸速率变化规律。在 4℃密封环境中鲜切猕猴桃的最大呼吸速率为 6.36 mL O2/(kg • h)和 6.53 mL CO2/(kg • h)。果蔬呼吸分为有氧呼吸和无氧呼吸，无氧呼吸会产生大量乙醇等无氧代谢产物而影响果蔬品质[24]。鲜切果蔬气调包装希望果蔬有氧呼吸降至最低安全水平但不会引起无氧呼吸。在本研究中，鲜切猕猴桃于 144h 后进入无氧呼吸状态，可耐受的气体浓度为 O28.11%和 CO29.99%。本研究结果可为鲜切猕猴桃果实的保鲜及包装材料参数的选择提供理论依据。