两个新台糖甘蔗品种的GISH分析

　　【摘 要】用 DIG 标记的原始亲本印度割手密(父本)DNA 和用 Biotin 标记的原始亲本黑车里本(母本)DNA 为探针分别对 2(新台糖 25 和新台糖 16)个云南甘蔗主栽品种进行双色基因组原位杂交(GISH)。由杂交结果可以看出，在 2 个供试甘蔗栽培品种的基因组中，含有栽培原种—— 热带种(黑车里本)血缘的染色体有 82-96 条，含有野生种——割手密(印度割手密 1、印度割手密 2)血缘的染色体有 10-25 条，而发生交换、重组的染色体有 2-4 条，都表现出明显的差异。GISH 技术为揭示甘蔗栽培品种基因组的血缘组成差异提供了科学依据。

　　本文源自罗宗苹， 农家参谋 发表时间：2019-06-14《农家参谋》(月刊)创刊于1983年，是由河南省科学技术协会主办的服务农家发展的刊物。本刊始终坚持“面向农村、立足农业、服务农民”的办刊宗旨，不遗余力地传播先进的科学技术与最新的致富信息，培育出了一批种植、养殖高手和市场经营能手，无数读者在《农家参谋》的指导下，摆脱了贫困，走上了富裕之路，成为至富带头人。

　　【关键词】甘蔗;染色体;基因组原位杂交

　　甘蔗(S.sinense Roxb )不仅是世界和我国最主要的糖料作物，而且在能源和动物饲料开发方面具有广阔的应用前景。甘蔗优良品种的育成，有赖于种质资源的开发和利用。甘蔗是高度多倍性的植物，现代甘蔗栽培品种是一个遗传背景复杂的多倍体 , 其基因组的主体成份为热带种血缘 , 同时又导入不少近缘种血缘 , 如割手密种、印度种、大茎野生种、中国种和斑茅等面对甘蔗复杂的遗传特性，人们为了更深的研究甘蔗，在甘蔗研究技术上应用了原位杂交。原位杂交 (in situ hybridization) 技术是 1969 年由 Gual 和 Par 首次提出的。它是一种把核酸分子杂交技术与组织学定位相结合的 DNA 分子标记技术，即利用标记的 DNA 探针 (probe) 与染色体上的 DNA 杂交，以检测细胞中特定基因在染色体上的位置、活性和表达。因这种杂交是待测 DNA 分子位置不变而进行的杂交，所以称之为“原位杂交”，具有特异性强、灵敏度高、定位准确等特点。

　　基因组原位杂交 (GISH) 是利用标记物标记基因组总 DNA，以其作探针与染色体制片进行原位杂交检测目标 DNA 的一种技术。甘蔗的根尖染色体制片较难获得清晰干净的染色体，本研究借鉴 GISH 技术在植物上的应用，从制取甘蔗良好的染色体制片入手，改进探针标记条件，确定恰当的探针总 DNA 与封阻总 DNA 的浓度比例，建立甘蔗 GISH 分析技术体系。为甘蔗创新种质材料的保存及在甘蔗育种中的应用提供科学依据，为新台糖抗逆、广适、高产、高糖的新品种的培育或对一些不良特性的进行改良。甘蔗育种家对常用的亲本材料进行亲缘关系分析 , 发现现有亲本主要来自常用的原始祖先热带种、印度种、割手密和大茎野生种 , 全世界甘蔗栽培种十之八九均含有这几个亲本血缘。目前，云南高原蔗区，在主栽品种中，新台糖品种(ROC10、ROC16、ROC20、ROC22、ROC25)的种植面积约占总面积的 45%，查阅以上新台糖甘蔗主栽品种的血缘关系可以看出：5 个台湾品种(ROC10、ROC16、ROC20、ROC22、ROC25)除了含有传统的热带种、印度种、中国种、割手密野生种等原始亲本的血缘外，又增加了“大茎野生种”的血缘，是大茎野生种的第 4、5 代;这些原始亲本(祖亲种)在栽培品种血缘中具有关键作用，云南主栽的这些甘蔗品种都有比较完整的系谱记录，为杂交亲本的选配提供了重要依据。

　　1 材料与方法

　　1.1  试验材料及所使用的仪器设备

　　1.1.1  试验材料

　　云南农业大学甘蔗所甘蔗资源圃所种植的新台糖 25 和新台糖 16 的幼嫩根尖。

　　1.1.2  试验仪器及设备

　　离心机、低温冰箱、PCR 仪、干燥箱、水浴锅、移液枪、ZEISS 荧光显微镜等。

　　1.2  试验方法

　　1)试验材料的种植;2)玻片的准备;3)探针的获得与标记;4)杂交预处理;5)杂交;6)杂交后的洗脱;7)杂交信号的检测。

　　2 结果与分析

　　本实验以 Biotin 标记的热带种黑车里本 DNA 作为母本探针、采用 DIG 标记野生种印度割手密 DNA 作为父本探针，与云南主栽的新台糖 25和新台糖 16 甘蔗品种进行单、双色杂交，染色体底色则用 DAPI 衬染，杂交图可以看到染色体上都有杂交信号。

　　基因组原位杂交中，经 DIG 标记系统标记后的父本 DNA 探针杂交信号为红色，经 Biotin 标记系统标记后的母本 DNA 探针杂交信号为绿色。双色原位杂交中(图 1，图 2)，母本探针的杂交信号仍为绿色，而 DIG 标记的父本探针的杂交信号除红色外还会出现橙红色，双亲探针的交叉杂交信号则为黄色，由结果发现，母本探针既能与母本染色体出现杂交(呈绿色)又能与父本染色体在特定区域杂交(呈黄色)，同时父本探针也不仅与父本的整条染色体杂交(呈红色或橙红色)，还与母本染色体的特定区域发生部分杂交(呈黄色)。

　　图1中 A：浅紫色为 DAPI 衬染的检测信号。B：红色代表 DIG 标记的父本 DNA 探针的杂交信号，C：以印度割手密及热带种黑车里本 DNA 标记的探针与新台糖 25(ROC25)得到染色体进行双色原位杂交的结果(比例 =10 µm)。A—C 中的白色长箭头示完整的父本染色体，白色短箭头示父本染色体断片，蓝色箭头示父母本间的重组染色体。

　　图2中 D：浅紫色为 DAPI 衬染的检测信号。E：红色代表 DIG 标记的父本 DNA 探针的杂交信号，F：以印度割手密及热带种黑车里本 DNA 标记的探针与新台糖 16(ROC16)得到染色体进行双色原位杂交的结果(比例 =10 µm)。D—F 中的白色长箭头示完整的父本染色体，白色短箭头示父本染色体断片，蓝色箭头示父母本间的重组染色体。

　　3 讨论与结论

　　3.1  讨论

　　1)基因组原位杂交(GISH )是对远缘杂交后代中的染色体进行鉴定的有效工具，用不同标记系统标记的双亲 DNA 探针可将来自不同亲本的染色体有效区分开来，即便对亲缘关系较近的亲本间杂交获得的后代材料的染色体也能获得理想的鉴定结果;

　　2)传统的观点认为不同染色体间的交换现象，只出现在减数分裂时联会配对的同源染色体之间，而不会在有丝分裂过程中出现。但也有研究发现染色体的重组现象发生于物种间杂交 F1 代，王先宏等的研究也在 YAU 01/49 后代材料中发现有 2 条染色体可能源于父、母本染色体间的互换，但是还有待进一步加以研究证实。因此有人推测不同染色体间的交换现象可能来自于受精后体细胞的有丝分裂，而与减数分裂过程无关;

　　3)本实验以 Biotin 标记的热带种(黑车里本)DNA 作为母本探针、采用 DIG 标记割手密(印度 1 号、印度 2 号)DNA 作为父本探针，与云南主要栽培的新台糖 25 和新台糖 16 甘蔗品种进行单、双色杂交，染色体底色则用 DAPI 衬染。杂交结果可以发现，几乎每个品种都有 2-4 条染色体各自的末端部分，都很明显的出现了另一亲本的探针杂交信号，可能是种重复序列表现出来的信号，也可能是母本的 1 条染色体与父本的一条染色体分别在末端出现交换，而形成了染色体的重组。

　　3.2  结论

　　本实验中材料的染色体组成

　　注：Ss：父本(印度割手密)，So：母本 ( 热带种 )，Ss & So：父母本间的重组染色体。

　　通过 GISH 技术在 2 个甘蔗栽品种新台糖 25 和新台糖 16 的基因组中的实验得出：含有栽培原种——热带种(黑车里本)血缘的染色体有 82-96 条，含有野生种——割手密(印度割手密 1、印度割手密 2)血缘的染色体有 10-25 条，而发生交换、重组的染色体有 2-4 条，都表现出明显的差异，为揭示甘蔗栽培品种新台糖 25 和新台糖 16 基因组的血缘组成差异提供了科学依据。