H2O2诱导H9c2细胞凋亡中circNFIX表达及作用

　　[摘要]目的 探討环状RNA NFIX(circNFIX)在H9c2细胞凋亡中的表达趋势和功能。方法 将H9c2细胞应用200 μmol/L的H2O2孵育0、1、3、6、12 h，应用荧光定量PCR方法检测H2O2诱导的H9c2细胞凋亡中circNFIX的表达趋势。将H9c2细胞分为空白对照组(未转染)、siRNA阴性对照组(转染siRNA阴性对照组)和siRNA组(转染siRNA)，应用荧光定量PCR方法检测siRNA对circNFIX抑制效果。将H9c2细胞分为对照组(未转染)、H2O2组(应用200 μmol/L H2O2孵育12 h)、H2O2+NC组(先转染siRNA阴性对照，余处理同H2O2组)和H2O2+siRNA组(先转染siRNA，余处理同H2O2组)，用TUNEL和Western blot方法检测敲低circNFIX对H9c2细胞凋亡的影响。结果 circNFIX表达趋势检测显示，随着H2O2孵育时间的延长，circNFIX的表达水平逐渐下降(F=23.677，P<0.01);转染siRNA可显著降低circNFIX的表达水平(F=424.70，t=24.44～25.97，P<0.01)。TUNEL和Western blot检测结果表明，转染siRNA使TUNEL阳性细胞率和Bax/Bcl-2表达水平显著降低(t=3.27～17.22，P<0.01)。结论 在H2O2诱导的H9c2细胞凋亡中circNFIX的表达水平减低，沉默circNFIX的表达抑制H9c2细胞凋亡。

　　[关键词] RNA，环状;过氧化氢;氧化性应激;细胞凋亡;心肌梗死

　　心肌梗死是一种缺血性心脏病，在全球有较高的发病率和死亡率[1-2]。随着溶栓和经皮冠状动脉介入治疗的应用，心肌梗死病人的存活率显著提高。然而，再灌注过程中超氧化物过载和钙稳态失调使线粒体膜通透性转换孔开放，进而引起心肌细胞凋亡[3]。凋亡的心肌细胞将被成纤维细胞代替，进而导致左心室的收缩功能障碍，最终发展为心力衰竭[4]。因此，亟需研究和明确心肌细胞凋亡的分子

　　机制。环状RNA是一类闭合环状的分子，具有保守性好、稳定性高、组织特异性和疾病发展阶段特异性等特征[5]。环状RNA有多种生物学功能，参与神经系统疾病和肿瘤等疾病的发病过程[6-7]。最近研究结果显示，环状RNA在心血管疾病的发生发展中发挥至关重要的作用[8]，而其在心肌细胞凋亡中的作用尚不明确。本研究探讨环状RNA NFIX(circNFIX)在H9c2细胞凋亡中的变化趋势和作用，为开发环状RNA相关的诊断标志物和治疗靶标提供实验依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 细胞与试剂

　　大鼠心肌细胞H9c2购自中国科学院(上海)细胞库;DMEM高糖培养基购于美国GIBCO公司;胎牛血清购于上海吉泰依科赛生物科技有限公司;青霉素/链霉素混合液购于北京索莱宝科技有限公司;Trizol试剂、反转录试剂和SYBR green购于宝生物工程有限公司;Lipfectamine 3000购于赛默飞世尔科技公司;荧光定量PCR引物购于华大基因公司;siRNA和阴性对照(NC)购于上海吉玛制药技术有限公司;TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购于上海翊圣生物科技有限公司;RIPA裂解液(高强度)、PAGE凝胶快速制备试剂盒(125 g/L)、Omni-ECL超灵敏化学发光检测试剂盒购于上海雅酶生物科技有限公司;Bax、Bcl-2抗体购于沈阳万类生物科技有限公司;GAPDH抗体、羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗购于武汉爱博泰克生物科技有限公司。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 细胞培养 大鼠心肌细胞H9c2培养于含体积分数0.05 CO2、37 ℃湿润的细胞培养箱中，应用含有体积分数0.10胎牛血清和体积分数0.01青霉素/链霉素混合液的DMEM高糖培养基进行培养。培养基每48 h更换1次，取对数生长期的细胞进行实验。

　　1.2.2 荧光定量PCR检测环状RNA和NFIX mRNA的表达 用Trizol法提取细胞总RNA，具体步骤参照Trizol试剂说明书。反转录按照反转录试剂说明书进行，反应条件为：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃结束。荧光定量PCR的反应条件为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，共40个循环。以GAPDH为内参，用2-△△CT法计算circNFIX的表达水平。每个样品设置3个复孔。引物序列见表1。1.2.3 候选环状RNA表达检测 选择对数生长期的H9c2细胞，分为对照组(无药物处理)、H2O2组(200 μmol/L H2O2孵育12 h)。收集细胞后，用1.2.2的方法检测候选环状RNA的表达水平。

　　1.2.4 circNFIX表达趋势检测 取对数生长期的H9c2细胞，分为0 h组(无药物处理)、1 h组(应用200 μmol/L H2O2孵育1 h)、3 h组(200 μmol/L H2O2孵育3 h)、6 h组(200 μmol/L H2O2孵育6 h)、12 h组(应用200 μmol/L H2O2孵育12 h)。各组处理相应时间后收集细胞，用1.2.2的方法检测circNFIX的表达水平。

　　1.2.5 siRNA转染效果检测 取对数生长期的H9c2细胞分为空白对照组(未转染)、siRNA阴性对照组(转染NC)、siRNA组(转染siRNA)。转染步骤按照Lipfectamine 3000说明书进行，转染24 h后收集各组细胞，用1.2.2的方法检测circNFIX和NFIX mRNA的表达水平。siRNA序列见表1。

　　NC组(先转染NC，其余处理同H2O2组)、H2O2+siRNA组(先转染siRNA，其余处理同H2O2组)。转染24 h后，除对照组外均加入H2O2(终浓度为200 μmol/L)，继续培养12 h。按照TUNEL检测试剂盒说明书检测各组TUNEL阳性细胞率。

　　1.2.7 Western blot检测Bax和Bcl-2蛋白的表达

　　实验分组及处理方法与1.2.6相同，培养结束以后加入RIPA裂解液提取总蛋白。各组样品经SDS-PAGE蛋白质电泳后，将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，然后用50 g/L脱脂奶粉室温封闭2 h。加入一抗(Bax，1∶500;Bcl-2，1∶500;GAPDH，1∶5 000)

　　4 ℃孵育过夜，然后加入二抗(羊抗鼠二抗1∶5 000;羊抗兔二抗1∶5 000)于室温孵育1 h，最后用ECL检测试剂盒显影。以GAPDH为内参，使用Image J软件分析条带的灰度值，结果以目的蛋白条带灰度值/GAPDH条带灰度值表示。

　　以上各指标检测均重复3次。

　　1.3 统计学分析

　　使用SPSS 21.0软件进行统计学分析，计量资料结果以[AKx-D]±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 环状RNA的筛选和circNFIX的表达趋势

　　应用荧光定量RCR检测H9c2细胞凋亡前后候选环状RNA的表达水平，结果显示，circNFIX在H9c2细胞凋亡前后变化最显著(t=17.535，P<0.01)。见表2。因此，选择circNFIX做进一步研究。对circNFIX表达趋势的检测显示，0、1、3、6、12 h组circNFIX相对表达量分别为1.00±0.01、0.92±0.06、0.84±0.04、0.79±0.05、0.62±0.02。随着H2O2处理时间的延长，circNFIX的表達量逐渐减少(F=23.677，P<0.01)，其中12 h组较0 h组减少了48%(t=9.074，P<0.01)。表明在H2O2诱导的H9c2心肌细胞凋亡中circNFIX的表达水平明显下调。

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