浅析影响直肠癌细胞增值的因素

一、细胞培养

人结肠癌细胞系CaCo2、HT29、HCT116、SW480、SW620、SW1116、LoVo均购自ATCC，并由上海消化外科研究所传代保存。LoVo采用含10％胎牛血清的F-12K培养传代；CaCo2、HT29、HCT116、SW480、SW620、SW1116均使用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液，置于37℃、5％CO2的培养箱中，以1∶2至1∶4的比例传代培养。

二、方法

1.样本收集及免疫组化染色：结肠直肠肿瘤标本取自上海市微创外科临床医学中心手术室。手术标本切除后生理盐水清洗，打开肠腔，剔除瘤体表面坏死及炎性肉芽组织；取肿瘤中心部位及距肿瘤5cm以上的正常肠黏膜全层组织，切成1cm块状后置入样本管。组织标本经4%甲醛溶液充分固定后，制作蜡块，切片、贴片。随后采用链霉素亲和素-过氧化酶复合物（SP）法进行免疫组化染色，DAB显色。TMPRSS4多克隆抗体购自美国Proteintech公司，1∶50稀释。

2.半定量RT-PCR：采用Trizol试剂（Invitrogen，美国）提取细胞总RNA。电泳鉴定RNA完整性，分光光度计260nm处测定RNA浓度，使用逆转录试剂盒（Takara，日本）在ABIPrismSDS7000中进行逆转录cDNA合成。上海吉玛生物有限公司合成如下引物：TMPRSS4上游引物5′-TCCAAGGACCGATCCACACT-3′，下游引物5′-AAGTTGTCGAAACAGGCAGAG-3′；GAPDH上游引物5′-GACATCAAGAAGGTGGTGAA-3′，下游引物5′-TGTCATACCAGGAAATGAGC-3′。cDNA在PCR仪(AppliedBiosystems，美国)中进行反应，50℃2min、95℃10min、95℃15s、60℃30s、72℃30s，共35个循环；然后，72℃10min，扩增产物于1％琼脂糖凝胶中，130V、30min条件下电泳并在紫外灯下摄片，成像保存。

3.Western印迹法：细胞在10cm培养皿（Corning，美国）中生长融合约90%时，PBS清洗2次后加入300μLRIPA，置冰上30min裂解充分后煮沸10min，随后13000r/min离心5min。取上清液，BCA法测定蛋白质浓度。每孔上样量100μg，加入5×上样缓冲液、去离子水至总体积一致后变性电泳（积层胶80V，分离胶120V），半干转法转膜（15V）70min后脱脂牛奶室温封闭2h，4℃下一抗（兔抗人TMPRSS4多抗，112831-AP，Proteintech，美国，1∶600稀释）孵育过夜。TBST洗膜3遍后加入一定比例稀释的相应二抗室温孵育1h，TBST洗膜2次，PBS洗膜1次后荧光发光显色。

4.siRNA瞬时转染：细胞生长至70%融合时胰酶消化，计数后按每孔3×105细胞铺6孔板，过夜。24h后按照Lipofectamine2000（Invitrogen，美国）说明书操作进行细胞转染。由上海吉玛生物有限公司设计并合成TMRPSS4-siRNA序列：5′-AAGUUGUCGAAACAGGCAGAGAACC-3′（si组）。仅转染Lipo2000的细胞为空白对照组，转染阴性对照序列的细胞为阴性对照组（NC组）。转染48h后用Trizol试剂提取细胞总RNA，72h提取总蛋白质。

5.CCK-8测细胞增殖：取转染后SW480细胞计数后铺于96孔板，每孔100个；设干扰组、阴性对照组和空白对照组，每组6个复孔。在第0、24、48、72、96和120h，分别于各孔加入CCK-8试剂（cellcountingkit-8，Dojindo,日本）10μL，37℃孵育2.5h，酶标仪测定各孔在450nm的吸光度值。以时间为横坐标、吸光度值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

6.AnnexinⅤ/PI流式检测细胞凋亡：转染48h后收细胞，取100μL细胞悬液（1×106个/mL）至流式管，用PBS洗涤1次，离心后加入300μL结合缓冲液，混匀，再加入5μL的AnnexinⅤ-FITC和5μL的PI，孵育15min后用流式细胞仪（BD，美国）上机检测。

7.划痕试验：6孔板转染，待细胞铺满后，用无菌枪头每孔笔直划线，PBS清洗3次，加入无血清培养液置培养箱孵育。24h后在显微镜下每孔随机选取视野观察摄片。

8.transwell迁移试验：取转染24h后细胞，无血清RPMI1640培养液重悬后计数，调至终密度为5×105个/mL。24孔板每孔内加入900μL含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，随后置入transwell小室（Corning，美国），小室内加入200μL细胞悬液（105个细胞）。培养箱孵育24h后取出，棉签拭去内室面细胞，甲醇固定小室外穿出细胞10min，1%结晶紫染色10min，PBS清洗3遍后，显微镜下观察摄片。

三、统计学方法

采用SPSS11．0软件进行统计学分析，计数资料采用χ2检验。P<0．05为差异有统计学意义。

1.免疫组化检测TMPRSS4蛋白在结肠直肠癌组织和正常肠上皮中表达标本免疫组化染色显示，TMPRSS4蛋白定位于细胞膜上，在肿瘤组织和转移淋巴结中均染色阳性，且转移淋巴结中TMPRSS4蛋白染色更强。表明TMPRSS4表达可能与肿瘤细胞迁移能力有一定相关性。

2.半定量RT-PCR和Western印迹检测TMPRSS4在结肠癌细胞株中的表达通过半定量RT-PCR检测发现，TMPRSS4基因在7株结肠癌细胞中有不同程度的表达，其中在HT29、SW480、SW620、SW1116中的表达相对较高。Western印迹检测亦有类似结果，有细胞均不同程度表达TMPRSS4蛋白，而HCT116、SW480和SW1116蛋白表达量相对较高。因此，本研究决定选用SW480细胞进行下一步试验。三、siRNA瞬时转染后SW480细胞中TMPRSS4蛋白表达下调在转染siRNA48h后，Western印迹法检测发现，与空白对照组和NC组相比，siRNA干扰组（si组）的TMPRSS4蛋白表达明显下降。

3.TMPRSS4下调可显著抑制SW480细胞的增殖能力siRNA处理SW480细胞株后，采用CCK-8法测定细胞增殖能力。在第1、2、3、4、5天不同时间点分别测定吸光度值，吸光度值可间接反映细胞增殖能力的强弱。与空白对照组和NC组相比，si组细胞增殖能力在48~96h时受到明显抑制（P<0.05)。

4.下调TMPRSS4诱导SW480细胞凋亡SW480细胞株转染TMPRSS4siRNA后孵育48h，收集细胞，用AnnexinⅤ/PI双染色法检测细胞周期，si组细胞凋亡比值为14.0%，而空白对照组和NC组分别为10.4%和10.1%，有统计学差异（P<0.05）。提示下调TMPRSS4可能有诱导结肠癌细胞凋亡的作用。

5.siRNA干扰TMPRSS4表达显著影响SW480细胞的迁移能力采用siRNA处理SW480细胞后，进行细胞划痕及transwell迁移试验。结果显示，si组的SW480细胞在划痕试验中的运动能力比对照组显著降低(P<0.05)；si组在transwell试验中的穿膜细胞数亦比对照组显著降低(P<0.05)。

四、讨论

Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶是一类新近发现的特殊蛋白酶，具有明显的组织表达特异性，且与耳聋、贫血、高血压和肿瘤等的发生相关。本研究探讨该家族成员TMRPSS4在结肠直肠癌组织中的表达及其对增殖、凋亡、迁移等方面的影响。采用siRNA干扰TMPRSS4表达后，发现肿瘤细胞的增殖能力减弱，同时细胞运动迁移能力也降低，这与Jung等先前的研究结果相一致。针对该蛋白质的其他研究表明，TMPRSS4可能通过作用于细胞间黏附分子或激活其他蛋白酶在组织发育和细胞分化中发挥重要作用；并通过发挥其蛋白酶的水解作用裂解病毒表面的红细胞凝集素，促进病毒在肺部的扩散而致病。因此，推测该基因可能通过靶向作用于细胞外基质及细胞-细胞间连接分子而在调控SW480细胞的增殖及迁移中发挥作用，具体机制尚有待后续研究来揭示。同时，流式细胞凋亡检测显示，在siRNA干扰后，SW480细胞的凋亡比例明显增加，这与干扰后细胞的增殖能力降低相一致，表明敲除TMPRSS4基因可能通过诱导细胞凋亡而抑制增殖。最近有研究表明，乳腺癌中TMPRSS4表达与淋巴结转移、病理分期差、肿瘤体积大以及总生存率和无病生存率低相关。本研究初步显示，TMPRSS4在结肠直肠癌组织和转移淋巴结中有不同程度表达，且转移淋巴结染色强度略高。因此，有必要进一步探讨TMPRSS4与结肠直肠癌病理分期、分级、淋巴结转移及病人预后间的相关性，为其作为预后预测因素提供依据。我们将继续探讨TMPRSS4对于结肠癌细胞增殖、凋亡、侵袭方面的具体作用机制，揭示这一基因对于结肠直肠癌发生、发展的作用。

作者：黄傲 周厚民 赵红超 全应军 金润森 乐飞 马君俊 冯波 郑民华 单位：上海交通大学青岛市市立医院