间质干细胞移植治疗POF的研究进展

MSCs治疗优势及其应用

1966年Friedenstein等［2］首先从骨髓中发现MSCs，是来源于中胚层的成体干细胞，广泛存在于全身结缔组织和器官间质中。MSCs在体外长期培养的过程中始终保持多向分化潜能，而且易于分离、培养、扩增及外源基因的导入和表达，免疫原性弱，具有强大的迁移能力。其分泌的多种细胞因子具有调节免疫、支持造血的特性，对于修复组织缺陷或损伤有独特的优势，遗传背景稳定，且不受胚胎干细胞研究中遇到的伦理问题限制。因此，MSCs在细胞治疗、基因治疗及组织工程中得到广泛的应用。目前研究较多的是骨髓MSCs、外周血MSCs、脐带MSCs、胎盘MSCs及羊水MSCs。骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)是存在于骨髓微环境中的一种成体干细胞，来源于发育早期的中胚层，是具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞。动物实验及临床研究证实，BMSCs可促进损伤组织结构及功能的修复，用于治疗脑、脊髓、心肌、皮肤及颌面部等多种损伤性疾病，临床已取得满意疗效［3－5］。但成人BMSCs存在病毒高度污染的可能和潜在的致瘤性，随着年龄增长其细胞数量和扩增、分化能力呈明显下降趋势，且供者BMSCs采集须行骨髓穿刺术，因患者易感染、体质较弱等因素限制了自体BMSCs移植的应用。近年来，自体外周血干细胞(peripheralbloodstemcells，PBSC)移植已成为继自体骨髓移植之后治疗恶性血液病、免疫缺陷性疾病和某些实体肿瘤的又一有效辅助方法，在治疗神经、心血管系统疾病等方面也取得满意疗效。PBSC具有更强的增殖能力、造血及免疫功能恢复快、来源及采集方便及痛苦小等优点。但外周血的祖细胞和多能造血干细胞只占骨髓细胞的1/104～1/105，需用血细胞分离器采集多次，同时需借助造血干细胞动员剂，使骨髓或其它部位的造血干细胞进入血流，以提高外周血造血干细胞的单次采集效果。

脐带间充质干细胞(umbilicalcordmesenchymalstemcells，UCMSCs)的研究是传统BMSCs的新生力量，UCMSCs多数生物学特征与BMSCs相似，但其增殖能力、CFU-F频率、CD106、HLA-Ⅰ表达和神经诱导分化能力等优于BMSCs。同时脐带来源广泛，便于取材，对供者无不利影响，不影响脐带造血干细胞的保存，无道德伦理限制［6］，且其干细胞输注相关的病毒和病原微生物感染率远低于BMSCs移植，是一类免疫缺陷细胞，不需经过严格配对，异体移植无免疫排斥反应或反应较弱，适于不同个体之间移植且易于转染外源基因。目前已用于治疗神经退行性疾病帕金森综合症、肺纤维化修复、类风湿、肾损伤、大肠炎、改善肝硬化后肝功能、抑制乳腺癌等领域以及作为基因治疗载体细胞［7－10］。因此，作为一种新型种子细胞，UCMSCs的应用具有更广阔的前景。另外，目前发现通过各种体外诱导方法，可使胎盘间充质干细胞(placentalmesenchymalstemcells，PMSCs)可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、神经细胞等多种细胞［11］。PMSCs来源广泛，供者无痛苦，污染机会少，分化能力较佳，增殖迅速，具有更强的长期增殖能力。Prusa等［12］首次证实，羊水细胞表达Oct-4转录因子，Oct-4被认为是鉴定多潜能干细胞的标志性基因。羊水来源干细胞同样具有多向分化潜能，培养条件适当可以分化出内胚层、中胚层、以及外胚层3个胚层的细胞［13］。近年羊水干细胞在组织工程学领域的研究有了新的突破，包括成功地构建了组织工程骨［14］、人工心瓣膜的体外培育［15］及异体移植后联合高压氧疗促进受损神经生长［16］等多个方面。羊水取材简便，既可在产前诊断时经羊膜穿刺获取，也可在分娩过程中收集。不会对母亲和胎儿造成伤害，安全性高，且不涉及伦理问题。

MSCs治疗卵巢早衰

近年来采用骨髓、脐带和羊水来源MSCs移植治疗化疗药物、免疫性卵巢炎、半乳糖和化学因子诱导的POF取得了明显效果。MSCs原位、腹腔或静脉注射后，可迁移、定植于卵巢，并在卵巢存活、生长，可恢复实验动物卵巢形态、大小和正常动情周期，增加卵巢各级卵泡数，促进颗粒细胞生长，抗颗粒细胞凋亡，改善卵巢内分泌功能，恢复受孕。

1体外研究

体外研究分析干细胞治疗作用的机理，目前主要研究干细胞与卵巢颗粒细胞共培养，检测其是否可抑制卵巢颗粒细胞调亡。POF主要的病理学表现为颗粒细胞凋亡，而凋亡调控涉及多种基因和蛋白，包括Bcl-2基因(B-celllymphoma/leu-demia-2，淋巴细胞瘤/白血病基因-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、细胞型Flice抑制蛋白(cellular-Flicelikeinhibitoryprotein，cFLIP)、P53等［17－18］。Bcl-2可以通过线粒体途径抑制卵巢颗粒细胞的凋亡，而Bax则可促进细胞的凋亡。cFLIP在健康卵泡中高表达而在闭锁卵泡中低表达，推测其具有抑制卵巢颗粒细胞凋亡作用［18］。一些细胞因子如血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)、胰岛素样生长因子-1(insulin-likegrowthfactor-1，IGF-1)、肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor，HGF)等也参与了凋亡调控过程［19－20］。体外培养BMSCs发现，其分泌的多种细胞因子如VEGF、HGF、IGF-1、碱性成纤维细胞生长因子(basicfi-broblastgrowthfactor，b-FGF)等，可减少细胞凋亡，促进上皮增生及血管生成，抑制炎症反应［21－22］。付霞霏等［23］研究报道，颗粒细胞与BMSCs共培养后，BMSCs能上调Bcl-2基因在颗粒细胞中的表达，并分泌具有抗凋亡作用和促血管生成的细胞因子，如VEGF，IGF-1和HGF，颗粒细胞凋亡率下降，细胞存活率上升，BMSCs细胞数越多，凋亡率越低，呈现数量依赖性。陈芳等［24］在体外实验发现，UCMSCs具有抑制卵巢颗粒细胞凋亡的作用。

2动物实验及体内研究

由于POF的病因尚不清楚，目前仍没有非常理想的POF动物模型。因化疗药物造模具有动物取材容易、病理结果与人一致、可用药物逆转、操作容易且造模投入人力和时间相对较少等优点，是目前常见卵巢早衰造模模型。目前研究主要针对化疗药物造模方式导致的卵巢早衰，观察移植干细胞的存活迁移情况，探讨MSCs移植对卵巢损伤大鼠卵巢结构、功能的影响及其可能作用机制，为进一步的研究和临床治疗提供实验依据。Lee等［25］报道，移植绿色荧光标记的BMSCs至环磷酰胺诱导的POF小鼠体内，发现小鼠卵巢内未成熟卵泡数量显著提高，且其远期生殖能力也有所改善。随后研究［23］发现，大鼠BMSCs的卵巢局部移植对化疗所致的卵巢早衰有明显的治疗作用，表现为大鼠卵巢各级卵泡数增加，E2浓度明显上升，FSH浓度明显下降，表明BMSCs能修复卵巢结构，改善卵巢内分泌功能。其机制可能与BMSCs能分泌VEGF、IGF-1、HGF等，抑制卵巢颗粒细胞凋亡有关。贺卫卫等［26］也证实，BMSCs可促进损伤卵巢功能修复，其机制可能是BMSCs通过腹腔血管进入血液循环到达受损伤卵巢，利用其多向分化潜能分化发育成受损伤的组织。BMSCs中可能还存在生殖干细胞，分化发育成各级卵泡及BMSCs可分泌多种细胞外基质，促进损伤卵巢功能的修复。另有研究［27－28］发现，BMSCs在体内能选择性地迁移和停留在机体受损伤的组织，可能与MSCs表面表达的生长因子、细胞因子和细胞外基质受体有关，这些因子驱使移植的BMSCs迁移至炎症部位。随着BMSCs移植时间的推移，免疫损伤卵巢的各级卵母细胞逐渐增多，BMSCs移植4周后，卵巢各部分细胞形态均与正常卵巢相似;而且凋亡的颗粒细胞数明显减少，表明BMSCs对卵巢免疫损伤的修复有效。2010年埃及国家研究中心在德国举行的世界生殖和不孕大会报告上报道，BMSCs使生育能力有缺陷的雌性实验鼠的卵巢功能得到康复。最近一项研究用卵泡刺激素受体(FSHreceptor，FSHR)基因敲除的雌性小鼠模型来研究人类POF［29］，静脉注射BMSCs后发现，小鼠成熟卵泡数及总卵泡数明显增加，与对照组相比，血清FSH下降，雌激素增加，并在移植骨髓干细胞的小鼠卵巢内检测到FSHRmRNA，表明BMSCs可到达小鼠卵巢，并刺激卵巢分化和表达FSHR基因，使FSHR对FSH产生反应，恢复卵泡的成熟发育和类固醇激素的生成，这为临床上有生育要求的POF患者恢复受孕提供了可能。李彩霞等［30］研究UCMSCs发现，其表达OCT4、Stella、Ifitm3等生殖系特异性标记物，且将其移植到POF小鼠体内后，具有向卵巢归巢的能力，并能在局部存活生长，提示UCMSCs可能具有向生殖细胞转化的潜能及卵巢损伤修复的作用。冷少华等［31］报道UCMSCs移植到动物体内后，能富集在卵巢早衰动物卵巢的卵泡周围，非闭锁始基卵泡数量显著提高，表明UCMSCs具有向生殖细胞分化的能力。朱少芳等［32］通过鼠尾静脉移植人UCMSCs到卵巢早衰的大鼠模型，发现体外标记PKH26的人UCMSCs可迁移至卵巢，主要沿基质血管分布，为追踪人UCMSCs移植后在体内生长、分化和转归提供依据。李洁等［33］通过移植人羊水来源干细胞(AFS)治疗大鼠卵巢早衰发现，AFS能有效地恢复动物的动情周期，提高体内雌激素分泌水平，改善卵巢组织卵巢早衰的状况，并且分阶段移植AFS比一次性移植AFS治疗效果更显著。综上所述，MSCs移植修复损伤卵巢组织的机制可能为:(1)MSCs移植后，在特定的微环境诱导下可分化为受损组织的细胞，部分补偿或替代其功能;(2)MSCs能分泌多种细胞因子，例如VEGF，HGF，IGF-I，TGF-β和GM-CSF等，通过旁分泌途径参与颗粒细胞生长和凋亡调节过程。在体外和体内都能抑制靶细胞凋亡，修复受损组织细胞。(3)MSCs分化成卵巢组织细胞后，可能分泌激素，调控体内激素水平。(4)MSCs中可能还存在有生殖干细胞，分化发育成各级卵泡，促进损伤卵巢功能的修复，MSCs可分泌多种细胞外基质，也有助于损伤卵巢的恢复。

总结与展望

近年来卵巢早衰的发病率逐年增高，在女性因素不孕患者中所占的比例亦有逐年上升的趋势，是妇科内分泌领域的常见疾病。MSCs作为组织损伤修复治疗的一种新方法，为临床治疗POF提供了新思路。MSCs在体外长期培养的过程中始终保持多向分化的潜能，而且易于分离、培养、扩增及外源基因导入和表达，具有强大的迁移能力，分泌的多种细胞因子具有调节免疫、支持造血的特性，免疫原性低，遗传背景相当稳定并且不受胚胎干细胞研究中遇到的伦理问题。MSCs的生物学特性及临床应用已经在多种疾病中得到应用，修复损伤组织可通过各种机制发挥作用，如分化、迁移、归巢、免疫调节及营养等。近年来采用骨髓、脐带和羊水来源MSCs移植治疗化疗药物、免疫性卵巢炎、半乳糖和化学因子诱导的卵巢早衰取得了明显效果，MSCs直接或静脉注射后，可迁移、定植于卵巢，并在卵巢存活、生长、可恢复实验动物卵巢形态、大小和正常动情周期，增加卵巢各级卵泡数，促进颗粒细胞生长，抗颗粒细胞凋亡，改善卵巢内分泌功能，恢复受孕。利用MSCs移植可能改善卵巢早衰患者临床症状及增加受孕几率。

综上，已有临床前研究显示，MSCs对卵巢早衰具有一定治疗作用，但缺乏系统、完善的大样本临床前研究证实其安全性和有效性，而且目前国内研究局限于初步的动物实验。各种MSCs抑制颗粒细胞凋亡和干细胞在动物体内迁移分布等方面的机制尚需进一步完善;MSCs向生殖细胞分化的潜能、细胞最佳移植方式、移植部位与数量、移植时间窗、移植后干细胞在体内的归巢、转归及对卵巢损伤修复的作用评价指标等均需要进一步的探索研究。MSCs有望彻底治愈POF，也开拓了化疗后POF治疗的新方向，具有可观的临床应用前景。（本文作者：李惠敏、李海波、李红 单位：南京医科大学附属苏州医院生殖与遗传中心）