稻曲病菌感染机制探究

本文作者：胡东维、王疏 单位：浙江大学生物技术研究所水稻生物学国家重点实验室、辽宁省农业科学院植物保护研究所

稻曲病菌的分类地位和基本生物学性状

稻曲病菌最早是Cooke对采自印度标样研究的基础上，将其命名为UstilagovirensCooke，即黑粉菌属一个种；随后Patouillard对来自于日本稻曲病标样进行了独立研究，将其命名为TilletiaoryzaePat.，即稻腥黑粉菌属一个种；1895年Brefeld认为TilletiaoryzaePat.的发育与产孢模式类似于狗尾草上的一种无性阶段，叫做Ustilaginoidea（绿核菌）属的子囊菌，因此将稻曲病菌划归到Ustilaginoidea属中，更名为U.oryzae（Pat.）Brefeld[1-2]。直到1934年Sakurai才发现了该病原菌的有性孢子，即菌核萌发产生子囊孢子，从此该菌被归于子囊菌的麦角菌属（Claviceps），但因一系列原因未获得有效命名。直到2008年Tanaka在比较研究的基础上将其从麦角菌属中独立出来，将其有性态定名为Villosiclavavirens[2]。

稻曲病的症状只出现在水稻的穗部，只在个别小花上产生黄色至深绿色的球状病原菌菌落。此前水稻植株的叶片、茎秆等部位没有任何异常症状。在田间自然条件下，一般在水稻开花后1周左右开始有幼嫩的稻曲球出现，开花3周后稻曲球体积达到最大并在其外围产生大量的厚垣孢子[1]。在一定环境条件下，在水稻成熟晚期稻曲球的表面可形成一至数个形状不规则的菌核，菌核可在一定条件下萌发产生子囊孢子[2,13-14]。稻曲病菌在各种固体培养基上生长十分缓慢，长满一个9cm直径的培养皿至少需要25—30d。在培养14d后可开始产生少量薄壁的分生孢子，培养约20d后可开始产生厚垣孢子；在液体培养基中，稻曲病菌只产生椭圆形的、薄壁的分生孢子；厚垣孢子萌发分生孢子，但厚垣孢子在室内条件下保存会很快丧失其萌发能力[15-16]。稻曲病菌的菌核可萌发进行有性生殖并产生子囊孢子，子囊孢子萌发则产生类似于液体培养产生的薄壁分生孢子[17]。厚垣孢子和子囊孢子萌发后最终都会形成薄壁小孢子[17]。稻曲病菌菌核在来年春季需2个月以上的时间方可萌发产生子囊孢子。大部分的菌核在稻田环境条件下难以越冬并成为来年的主要初侵染源[13]。

稻曲病菌对水稻幼苗的侵染

早在20世纪60年代，Ikegami就对稻曲病菌的苗期侵染进行了组织学研究。结果发现，稻曲病菌可以成功侵染水稻萌发初期的幼嫩胚芽鞘，并沿着韧皮部中的筛管外表面进行扩展，直至分蘖的中晚期；但并没有发现稻曲病菌能够像黑粉菌那样抵达植株茎尖部的穗原基[18-19]。郑大伟等发现，稻曲病菌菌丝在侵染点处稍稍膨大，形成类似于附着胞结构，然后侵入水稻胚芽鞘表皮细胞的角质层下生长，继而以胞外扩展的方式进入组织深层（图1）[20]。稻曲病菌不能成功侵入水稻叶片，也没有检测到能够侵入根部。但在后续几年的田间试验中，苗期成功接种的幼苗，在田间条件下并未发病。需要指出，2009—2011年中国稻曲病仅零星发生，是否存在大气候环境的影响，则尚未明确。Ditmore等近年来也对稻曲病菌的苗期侵染进行了研究。细胞学观察发现稻曲病菌可侵染水稻幼嫩的胚根；同时PCR检测表明病原菌可扩展至整个植株包括穗和籽粒[21-23]。

中国许多学者多年来对水稻种子带菌是否可导致水稻发病问题做了大量的田间比较研究，部分结果表明种子带菌可导致水稻发病[24-25]，而一些研究结果则相反[26]。也有试验表明苗期和抽穗期均可成功侵染[27]。分析这些结果，其共同点均是最终病穗率都比较低，远远低于高发病年份高感品种田间自然发病率，因此需要更多年份的试验来验证。此外，缺乏带有特殊标记的稻曲病菌菌株，也使得上述研究是否真正诱发侵染仍存质疑。Tang等采集了田间自然发病的病粒数高的重病穗，然后对其穗轴和稻曲球下的小穗轴进行了细胞学观察，没有发现病菌菌丝的存在，说明所检测的稻曲球是病原菌穗部局部侵染导致[28]，从一个侧面说明稻曲病菌在苗期侵染后，在自然条件下很难或不能有效扩展到穗部并引发病害。

水稻孕穗期稻曲病菌的侵染

稻曲球是稻曲病的唯一可见症状，因此大部分学者认为稻曲病菌的侵染应该在孕穗或开花期。国内外大量的穗部接种试验表明，孕穗期接种能够大幅度提高水稻的发病率，其中一些新的注射接种方法可以使病穗率达到100%，单穗病粒数也比较高[29-32]。对于稻曲球发育过程早在100年前就有了简单的观察和描述，认为稻曲病菌的侵染可分为明显不同的2个时期，即在小花发育的早期和籽粒成熟后期，其中早期侵染导致子房破坏，但花药和柱头仍保持完整；而后期侵染可导致部分或所有胚乳被菌丝取代[1]。王国良对稻曲球的发育过程进行了系统、细致的解剖观察，发现孕穗早期水稻小花柱头和子房上有大量菌丝的积累，由此推断病菌应是从水稻的柱头侵入的，侵入后由子房、柱头提供营养，迅速向花药及整个颖花内腔发展蔓延，最后形成稻曲病菌厚垣孢子球[33]。刘水芳等也得到了类似的结论[34-35]。蔡洪生等利用人工接种方法，发现稻曲病菌菌丝最先出现在花丝和花药上，后来才出现在柱头上[36]。但上述研究均没有严格的组织病理学观察，没有在组织或细胞内部检测是否存在病原菌。

Tang等利用人工接种方法，挑取早期侵染的小花，然后对整个小花进行固定和树脂包埋，继而对整个小花的连续半薄切片进行观察，同时对重点部位进行定位和超薄切片观察[28]。结果发现，稻曲病的初侵染位点是水稻的花丝组织，并最易侵染位于子房和浆片之间的3个花丝（图2）。连续切片的分析结果也表明，稻曲病菌从不侵染水稻子房和花药，但偶尔会有次生菌丝侵染柱头和浆片的外围组织。病原菌侵染模式属于细胞外侵染和扩展，病原菌菌丝不直接穿透和进入寄主细胞，只在细胞间穿行，并最终将花丝组织的细胞壁完全降解。在稻曲球发育过程中，稻曲病菌虽然产生毒素但并不杀死寄主细胞，因此稻曲病菌属活体营养型病原菌[28]。这在机制上与一般的活体营养型及死体营养型病原菌均有所不同[37]，比较少见。张震等也指出杂交水稻的不育系比较感病[35]。这说明不同水稻品种的花丝可能在发育和结构等方面存在差异。到目前为止，几乎所有对新鲜稻曲球的解剖都表明，稻曲球内含有6个水稻花药[28,33,35,38]。加之稻曲病菌不能侵染幼嫩的子房，所以侵染成熟籽粒的可能性更小。至今还没有组织学和超微结构的证据证明稻曲病菌能够侵染幼嫩的或成熟的水稻籽粒。

病原菌孢子萌发特性与水稻发育的时空关系

除了细胞学对侵染过程的检测外，探讨病原菌产孢类型、孢子萌发习性以及水稻发育时期，对于制定侵染机制研究的策略与途径有非常重要的帮助。稻曲球外层是大量的厚垣孢子，厚垣孢子萌发后可产生数个薄壁的小孢子，这些小孢子可用于接种和侵染水稻[1,3-4,39]。但是厚垣孢子在室内条件下的存活能力非常有限，并在1个月后大部分孢子失去萌发能力[16]。因此，水稻产区当地的厚垣孢子只适合作为水稻苗期的初侵染源。当然，早熟水稻产生的厚垣孢子也可以作为晚熟水稻的侵染源。同样，通过大气长距离传播，早熟稻区的厚垣孢子也可以侵染晚熟稻区的水稻。

在自然状态下稻曲球上往往会产生菌核，成熟的菌核往往能够存活一至数年。但对于子囊孢子致病性和菌核在中国的分布等情况的研究还很缺乏[4,13]。有研究表明，菌核在田间的萌发往往需要数月的时间，萌发后所产生子囊孢子的时期与东北、四川等地水稻孕穗期比较接近，因此可能是适宜的初侵染源[13]。目前对于稻曲病菌菌核的研究也相对较少。云南、四川、贵州、东北、西北等温差较大地区菌核比较常见，而长江中下游地区、华南和福建相对较少。其实至少在长江中下游地区菌核也普遍存在，只不过往往发生在晚熟的品种上，采集和调查最好在水稻收获前的数天进行；田间调查的时间太早会得出菌核缺失的假象。印度学者的研究也发现，稻曲病菌菌核多出现在高海拔地区[14]，也说明低温或较大的昼夜温差有利于菌核的形成。进一步研究不同稻区菌核产生的多少及其成熟度、菌核在自然条件下的存活率与萌发过程，对于确定它能否作为主要初侵染源至关重要。

稻曲病菌中间寄主

另外一个问题是，是否存在稻曲病菌的中间寄主及其在病害循环中的作用。Shetty等发现旱黍草上发现类似稻曲球的病原菌，将水稻和旱黍草上2个不同来源的病原菌交叉接种可致病[40]。Atia则报道在埃及发现稗草和白茅2种杂草可感染稻曲病[7]。中国黎毓干等报道在鼠尾粟上发现了类似稻曲病的病粒[41]。在中国很多地区的稻田都有人发现过带有类似症状的杂草，但由于研究手段的限制，这些研究或未进行病原菌分离，或未进行分子生物学的验证。另外，就其普遍程度来说，这类杂草被感染的情况是比较罕见的，因此对稻曲病菌初侵染的贡献估计不会很大。

问题与展望

从现有的证据来看，稻曲病菌孕穗期侵染无疑是一种主要侵染方式。但是厚垣孢子还是子囊孢子作为主要初侵染源尚不清楚。其中子囊孢子的产生和萌发试验在方法上尚存在一些困难。对稻曲病重灾区的菌核产生情况以及子囊孢子的致病性研究应是未来研究的重要方向。

对于病原菌苗期侵染及其扩展问题，首先要有适当的带有特殊标记的菌株、病原菌原位检测的方法和建立一整套适宜水稻发病的栽培管理措施。Wang等分离到一个致病性良好的白化菌株，为苗期侵染的观察提供了直观的标记[42]。另外，日本[43]及中国浙江大学、西北农林科技大学、江苏省农业科学院、浙江省农业科学院等多家实验室均通过遗传转化得到了带GFP标记的菌株；但带有GFP菌株的稳定性和致病性尚待观察，目前发现转化菌株中GFP丢失现象很常见。此外，王永强等的研究发现，中国稻曲病菌的rDNA-IGS序列分为6种长度类型，其中＞96%稻曲球均为400bp的常见型，另外5类型为稀有型[44]（其中一罕见类型未发表，GenBank登录号为JN036608）；用这些稀有型菌株进行苗期接种，并使用对植株的整个生长过程中的不同器官和最终植株上产生的稻曲球进行rDNA-IGS序列长度多态性的PCR检测，就能够有效避免田间稻曲病菌孢子对分子检测的干扰，客观了解稻曲病菌在水稻体内的扩展过程。

从技术层面来讲，完整的细胞学证据链是澄清侵染机制必不可少的。Sesma等也正是这样证实了稻瘟病菌具有系统性侵染的能力[45]。Zhou等建立了高灵敏度针对稻曲病菌的嵌套PCR方法[46]；但rDNA在基因组中重复次数较多，以其序列特征为基础的PCR检测难以完全排除植株表面病原菌孢子的干扰。所以筛选更多带有特异性分子标记的菌株至关重要。对于细胞学检测来说，由于稻曲病菌菌丝特别纤细，在光学显微镜下单条菌丝在切片上往往不易捕捉，因此超微结构分析是必不可少的。选择遗传稳定、产孢量高、致病性强的GFP转化菌株，利用激光共聚焦显微镜进行活体、连续跟踪研究，是研究苗期侵染的理想方法。

目前已经明确了稻曲病菌在穗部选择性侵染水稻花丝，下一步研究的焦点则应是侵染的生化机制。首先是为什么病原菌会选择性的侵染水稻花丝组织？花丝的结构发育和特定敏感时期的结构特征、花丝表面物质成分、病原菌胞间侵染的细胞壁降解酶、病原菌从花丝获取营养的机制、杂交水稻花丝敏感的原因与水稻抗病性改良途径等将需要逐一进行探讨。在这方面，稻曲病菌的近缘病原真菌－麦角菌已有较好的研究积累[47-54]，可为稻曲病菌侵染机制的研究提供借鉴。此外，植物内生真菌与寄主互作机制的研究方法，也可以加以利用[55]。