棒状乳杆菌运用前景探讨

本文作者：冯婷婷、方芳、堵国成、陈坚 单位：江南大学食品与科学技术国家重点实验室、江南大学生物工程学院

市售泡菜、家庭自制泡菜、发酵香肠、天然奶疙瘩(新疆)、天然发酵酸奶。培养基LB培养基：蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl1g，蒸馏水100mL；MRS(deman，Rogosa，Sharpe)、BHI(BrainHeartInfusion)、MH(Meller-Hinton)培养基：OXIOD公司。磷酸盐缓冲液：NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO4•12H2O3.63g，KH2PO40.24g，蒸馏水1000mL，pH7.0。大肠杆菌、产碱假单胞菌、荧光假单胞菌、石油假单胞菌、嗜酸乳杆菌(LactobacillusacidophilusATCC4356)：本实验室保藏菌株；肺炎克雷伯氏菌：江南大学中国高校工业微生物资源与信息中心；鼠伤寒沙门氏菌、空肠弯曲杆菌：爱尔兰国立科克大学。大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌：LB培养基，37℃摇瓶培养；产碱假单胞菌、荧光假单胞菌、石油假单胞菌：LB培养基，30℃摇瓶培养；鼠伤寒沙门氏菌：BHI培养基，37℃摇瓶培养；空肠弯曲杆菌：BHI液体培养基，MH固体培养基，37℃(5%CO2)培养；嗜酸乳杆菌：MRS培养基，37℃(5%CO2)静置培养；胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K：上海生工生物工程有限公司。

从市售泡菜、家庭自制泡菜、发酵香肠、天然奶疙瘩(新疆)、天然发酵酸奶等发酵食品中取样加到20mLMRS液体培养基中，37℃(5%CO2)静置富集培养12h。用磷酸盐缓冲液(pH7.0)按梯度稀释培养液，涂布于添加0.5%CaCO3的MRS平板，37℃(5%CO2)静置培养48h。挑选有溶钙圈、表面光滑或稍粗糙、不透明、乳白或灰白色、有光泽的单菌落划线分离到MRS固体培养基上。48h后，选取革兰阳性、无芽孢、杆状菌(乳酸杆菌)进行培养和保藏。

挑取上述产生溶钙圈的乳酸杆菌点种在MRS固体培养基的平板上，37℃(5%CO2)静置培养24h。然后将培养好的指示菌(大肠杆菌、产碱假单胞菌，107cfu/mL)与软琼脂(含琼脂0.75%~0.8%)培养基按1:100(v/v)混匀，倒在含乳酸杆菌的平板上。适宜温度下培养过夜，筛选可产生抑菌圈的乳酸杆菌。将具有抑菌效果的乳酸杆菌接种于MRS液体培养基中，37℃(5%CO2)静置培养24h，离心(8000r/min，4℃)15min取上清液，经0.22μm滤膜过滤后置于4℃冰箱保存。复筛平板底层为2%(w/v)素琼脂培养基。指示菌为大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、产碱假单胞菌、荧光假单胞菌、石油假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌和空肠弯曲杆菌。将培养好的指示菌(107cfu/mL)按1:100(菌液:软琼脂体积比)混匀后倾倒在放有牛津杯的底层培养基上。待凝固后取出牛津杯，在孔中加入100μL乳酸杆菌发酵上清液，在适宜温度下培养12~16h，测量抑菌圈直径。提取乳酸杆菌的全基因组，用16SrDNA的通用引物进行PCR扩增和测序(上海生工生物工程有限公司)。将得到的序列通过BLAST在NCBI中进行序列同源性比对。

将菌株在产胞外多糖培养基上接种后于37℃(5%CO2)静置培养24h，用接种针挑取菌落观察是否有拉丝现象。将培养基培养24h的培养物，离心后用磷酸盐缓冲液悬浮菌体。将菌体接种到耐盐性检测培养基中，于37℃(5%CO2)静置培养24h，以MRS空白培养基作为空白对照，测定600nm下的OD值，比较菌株的生长情况。将磷酸盐缓冲液悬浮后的菌体接种到耐硝酸盐检测培养基中，于37℃(5%CO2)静置培养24h，以MRS空白培养基作为空白对照，测定600nm下的OD值，比较生长情况。将悬浮后的菌体穿刺接种于含有溴甲酚紫的软琼脂柱中，置于37℃(5%CO2)静置培养24h，观察变色情况。软琼脂柱颜色由紫色变为黄色说明产酸。在不含溴甲酚紫的软琼脂柱中穿刺接种后，在上面加盖一层约5mm厚的2%琼脂。若软琼脂柱内产生气泡或2%琼脂被顶向上的现象，说明有气体产生。将菌株接种于含有精氨酸溶液的PY培养基中，并将接种于不含精氨酸的PY培养基作为对照，37℃(5%CO2)静置培养48h。离心后取上清液，向上清液中加入数滴奈氏试剂，若出现橙黄色或黄褐色沉淀，说明产氨。

将菌株划线接种于MRS液体培养基中，37℃(5%CO2)静置培养24h，将过氧化氢快速检测试纸条没入发酵液1s后取出，10s后观察变色情况。通过颜色比对判定是否有H2O2产生。将菌株接种于V-P反应培养基中，空白培养基作为对照，37℃(5%CO2)静置培养24h后，向培养液中加入40%(w/v)KOH溶液10~20滴，再加入等量的5%(w/v)α-萘酚溶液，混匀后于沸水浴加热2min，若出现红色则为阳性。将菌株穿刺接种于产H2S检测培养基中，未接种的培养基作为空白对照，37℃(5%CO2)静置培养24h。若有黑色物质产生，说明有H2S生成。培养基中，37℃(5%CO2)静置培养48h，在培养液中加入格里斯试剂，若溶液变为粉红色、玫瑰红色、橙色或棕色则表示硝酸盐被还原为亚硝酸盐，反应为阳性，否则为阴性。将接种的石蕊牛奶培养基置于37℃培养24~72h，观察石蕊牛奶产酸和凝固反应。若石蕊牛奶变为红色，则有酸产生，当酸度很高时，可使牛奶凝固。将菌株接种于MRS液体培养基中，置于37℃培养72h，以嗜酸乳杆菌ATCC4356作为对照，每隔12h取样测定pH，观察pH变化情况。将菌株接种于含有不同氨基酸的生物胺检测培养基中，37℃(5%CO静置培养48~72h，观察显色情况。若培养基由棕黄色变为紫色，则说明有生物胺产生，并且每种氨基酸都有对应的生物胺(组氨酸、色氨酸、酪氨酸、精氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸分别对应组胺、色胺、酪胺、精胺或亚精胺、尸胺、苯乙胺、腐胺)。

从5种食品样品中共分离到产生溶钙圈以及外观符合乳酸杆菌特征的菌株共169株。以大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、产碱假单胞菌、荧光假单胞菌、石油假单胞菌、空肠弯曲杆菌和鼠伤寒沙门氏菌为指示菌，从家庭自制泡菜中筛选到一株对7株指示菌都具有抑菌作用的乳酸杆菌BBE-H3。经过16SrDNA序列测序和比对，鉴定出该菌株为棒状乳杆菌(Lactobacilluscoryniformis)，命名为棒状乳杆菌BBE-H3。

对棒状乳杆菌BBE-H3主要发酵特性的检测结果如表2所示，棒状乳杆菌BBE-H3具有典型的乳酸菌发酵特性，并且在7种生物胺检测培养基中，无相应生物胺产生。乳杆菌ATCC4356在发酵12h后，其发酵液的pH变化曲线基本平衡。可见，棒状乳杆菌BBE-H3产酸速度与嗜酸乳杆菌ATCC4356基本接近，其培养24h后的产酸能力好于嗜酸乳杆菌ATCC4356。

本研究从家庭自制泡菜中筛选到一株对革兰阴性菌如大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、空肠弯曲杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、产碱假单胞菌、荧光假单胞菌和石油假单胞菌具有抑制作用的棒状乳杆菌BBE-H3。对棒状乳杆菌BBE-H3的发酵特性考察结果表明，棒状乳杆菌BBE-H3具有典型的乳酸菌发酵特性，可耐受8%NaCl和400mg/L的亚硝酸盐，并且不发酵葡萄糖产气，不产生物胺、不水解精氨酸产氨、不产H2O2和H2S等影响食品品味的物质，产酸性能好，具有作为发酵食品安全生产菌株的应用前景。