蛋白电泳测量运用计算机扫描法

本文作者：林林、何广源 单位：曾广东省顺德中医院检验科

１材料与方法

１．１标本来源

取自陆军总医院检验科常规检查健康人血清３０份。

１．２仪器与试剂

电泳仪１套；计算机（带有Ｗｉｎｄｏｗｓ操作系统和安装Ａｄｏｐｅｐｈｏｔｏｓｈｏｐ及Ｅｘｃｅｌ等软件）１台，扫描仪１台（光学分辨率在１０００ｄｐｉ，吸光度２．８以上）醋酸纤维薄膜等。巴比妥缓冲液（ｐＨ８．６离子强度为０．０６ｍｏｌ／Ｌ）；配置好后用１ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠（ＮａＯＨ）溶液调节ｐＨ值至８．６。染色液：０．１％氨基黑１０Ｂ，漂洗液：取蒸馏水８００ｍＬ、甲醇５０ｍＬ及冰醋酸１５０ｍＬ混合而成。透明液：石蜡油透明液。

１．３操作

参照《全国临床检验操作规程》蛋白电泳操作方法［１］，对点样和透明扫描几个步骤加以改进。

１．３．１自行制备点样器

（１）常规分析（剪切后用ＮａＯＨ浸泡洗脱比色法）：先用砂轮将盖玻片打磨平滑，再用两块载玻片夹住盖玻片，露出１ｃｍ，用透明胶纸绑紧就成了一个很好的加样器了。（２）扫描法：把盖玻片截掉一半，用同样的方法绑紧。或者剪取３ｃｍ×１ｃｍ的滤纸条，加样效果也不错。

１．３．２透明

将脱色吹干后的薄膜浸入透明液中，约１０ｍｉｎ薄膜完全透明，然后将膜条置于洁净、干燥的玻璃板或透明胶片上［２－３］。

１．３．３扫描

用高分辨率扫描仪透射扫描薄膜［４］，分别对血清中清蛋白（ＡＬＢ）及α１、α２、β、γ球蛋白５种成分进行扫描分析。扫描条件为５００ｄｐｉ，保存为ＲＢＧ模式ｔｉｆｆ文件。

１．３．４应用

Ａｄｏｐｅｐｈｏｔｏｓｈｏｐ软件，将每个图像分１０×１００个区间，并用ＩｍａｇｅＴｏｏｌ图像分析软件分析信息参数分别记录各区间的Ｃ、Ｎ、Ｙ、Ｋ、∑、Ｒ、Ｌ、ａ、ｂ等图像色谱参数数据，将上述参数导入Ｅｘｃｅｌ电子表格中，运用Ｅｘｃｅｌ的引入函数，插入图表，识别低段等功能，可以画出蛋白质组分分布曲线，百分含量。

１．４方法学评价

采用配对数据ｔ检验，以陆军总医院Ｓｅｂｉａ全自动蛋白电泳分析仪为参照，分别比较扫描法和常规法与Ｓｅｂｉａ蛋白电泳仪检测结果之间的差异，以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。

２结果

扫描法和常规法与Ｓｅｂｉａ蛋白电泳仪检测结果之间的差异分别见表１、２。实验结果表明，扫描分析测定法与Ｓｅｂｉａ蛋白电泳仪检测结果不存在差异，以Ｓｅｂｉａ全自动蛋白电泳仪检测结果为参照，扫描分析测定法在方法学上，可以接受，各项ｔ值均小于常规法，而且在操作上省去了剪切、洗脱、比色等烦琐工夫，避免因此而带来的误差。

３讨论

３．１本实验方法在电泳的前期操作与改良的常规方法一样［５］，后期的检测法是根据电泳图谱的色深（吸光度值）直接反映了该区带蛋白质的含量，透明胶片的色深与数字化图谱的ＲＢＧ信息参数呈反相关，与油墨量∑和Ｌ（灰度）呈正比（用油墨量∑为参数的分析结果与Ｓｅｂｉａ结果最为符合）。由于蛋白分析是测其相对含量，通过分析其色谱参数可计算出蛋白各组分的相对含量百分比。采用了计算机Ａｄｏｐｅｐｈｏｔｏｓｈｏｐ应用软件和ＩｍａｇｅＴｏｏｌ图像分析软件（试用版）以及Ｅｘｃｅｌ电子表格统计软件分析系统，但现在几种软件中的综合使用会带来工作量的增加，分析时间较长，离实际应用还有一段距离，这要求检验人员必须与软件专业人员一起自行研究编写一种应用。软件该软件能直接将图像色谱信息参数记录下来，并用相应的计算分析软件（可以是Ｅｘｃｅｌ，也可以是其他数据分析软件）分析图像色谱参数，从而计算出蛋白质各组分的百分含量，真正做到图像处理、分析、计算一体，其经济效益和社会效益是非常有前景的。

３．２蛋白电泳的分离效果直接影响到分析结果的准确性和稳定性，因此往后研究工作的重点在提高电泳的分离质量［６］。总结起来，主要有如下几方面：（１）是电泳支持物的选择上，可以比较琼脂糖凝胶与醋纤维膜的分离效果和稳定性。（２）是加样的方法上可以借鉴全自动蛋白电泳仪的加样装置，选择质地均匀、吸水性能好、蛋白质电渗作用小的滤纸，当然还要考虑硬度和厚度等因素，可制成一排多个标本的加样器。（３）是可购买较高配置的电泳仪，使电泳电流、电压稳定，增大可调电压范围。