皮革染料生物降解探究

本文作者：郑力文、李彦春、吴渝玉、陈玉峰、刘洁 单位：山东轻工业学院

前言

在皮革染色过程中，所用染料并不能被皮革完全吸收，一部分染料随废水排放而造成污染。废水中残存的染料即使浓度很低，排入水体也会造成水体透光率和气体溶解度降低，导致生态系统的破坏。皮革生产中所用染料种类多、结构复杂，又多属于难降解物质。同时，人工合成的染料通常含有复杂的芳香环结构，化学稳定性高，还具有一定程度的生物毒性，尤其是部分染料的降解中间体的毒性强，其排放严重污染环境。近年来随着对高浓度染料废水处理研究的增多，出现了如光催化、吸附等新型物化处理材料，但对染料的物化法处理运行成本通常较高，且容易产生二次污染。

微生物具有繁殖速度快、适应性强等特点，利用高效脱色微生物进行环境污染整治不仅成本低，且可减少二次污染的产生，因此，制革厂对含染料废水的处理依然以生物处理方法为主。研究皮革染料的生物降解性对于评估其在生态环境中的滞留情况以及指导染料的选用具有重要的现实意义，而且可以为选择合理的染料生物处理方案提供理论依据。染料的种类繁多，按照其发色基团的不同可将其分为偶氮染料、三苯基甲烷类染料和蒽醌型染料等。其中偶氮染料是目前制革生产中使用最广、用量最大的染料，占染料总用量的70%。本文以偶氮染料、三苯基甲烷类染料和蒽醌染料的生物降解机理和脱色酶等为基础，综述了皮革相关染料的生物降解研究进展，以期为皮革染料生物降解的深入研究乃至工程应用提供借鉴作用。

1染料降解菌及脱色路径研究进展

1．1偶氮染料降解菌及脱色路径

1．1．1偶氮染料的降解菌研究进展

偶氮染料是制革生产过程中使用量最大的一类染料，约占全部染料的70%左右。偶氮染料的发色基是偶氮双键，助色基是氨基、羟基、甲基和磺酸基等。自20世纪70年代末发现某些可以降解偶氮染料的肠道细菌以来，染料的生物脱色和降解研究越来越受到学者们的重视，目前已分离出对偶氮染料具有脱色效应的菌株主要包括芽孢杆菌、黄单胞菌、克雷伯氏菌等十几个菌属。已发现的偶氮脱色菌大多数是在厌氧条件下非特性还原偶氮键，从而使染料产生脱色。OAn-janeya等人［1］从染料污染土壤中提取出了2种在酸性间胺黄的生物脱色过程中，均具有一定作用的菌种，分别为Bacillussp．AK1和Lysinibacillussp．AK2。许玫英等人［2］从印染废水活性污泥中分离得到一株脱色希瓦氏菌(Shewanelladecolorationis)S12，具有高效的染料脱色活性，该菌株在偶氮染料浓度为50mg/L的培养基中培养4h后，对染料的去除率达到96%。好氧条件下对偶氮染料具有还原脱色能力的菌株近年来也被陆续发现，但这些菌株多较难以偶氮染料作为唯一碳源和能源进行好氧生长。E．Franciscon等人［3］则将一株兼气性克雷伯氏菌用于微好氧/好氧降解偶氮染料的工程应用。研究也发现了少量能以偶氮染料为唯一碳源和能源进行好氧生长的菌株，Kul．la等人［4－5］从菌群中分离出XenophilusazovoransKF46F和PigmentiphagakullaeK24，它们可分别以偶氮染料羧基橙Ⅰ和Ⅱ为底物进行生长。Coughlin等人［6］研究证明了Sphingomonas1CX对几种磺化偶氮染料和低浓度的酸性橙7具有降解能力。然而，目前研究的好氧生物降解偶氮染料多是在摇床好氧条件下以较大接种量培养，因此这类好氧偶氮染料脱色效应，实质可能是通过好氧菌对培养基中氧气的大量消耗，造成局部厌氧条件，从而促进偶氮双键的酶促还原，其偶氮还原的实质仍然是厌氧还原。

1．1．2偶氮染料脱色路径研究进展

在偶氮双键断裂的过程中，参与催化的酶通常统称为偶氮还原酶。对于偶氮类化合物在偶氮还原酶催化下的降解机理，到目前为止研究得并不十分清晰。过去认为偶氮染料还原生成芳香胺是一步反应，然而随着研究的深入，有人指出在这一过程中有可能存在一个反应中间体。Chang等人［7］在偶氮染料Red22脱色研究中，认为这个过程中可能有不完全还原中间体的存在。Nakanishi等人［8］则在偶氮还原酶酶促动力学研究中发现，在酶促脱色反应中染料和NADH作为双底物符合乒乓原理。通过计量学计算，推导出还原过程可能存在加氢偶氮苯的中间体。严滨等人［9］则以甲基红为底物，运用紫外光谱、液相色谱与质谱研究了偶氮染料的降解过程，验证了在偶氮染料还原过程中加氢中间体的存在，提出甲基红偶氮双键的还原机理，如图1所示。在厌氧条件下细菌的偶氮还原反应，是在非特异性还原酶作用下的电子传递过程。偶氮染料作为末端电子受体，接受从还原中间体传递来的电子而被还原，细菌可能在这一过程中获得生长所需的能量。

1．2三苯基甲烷染料降解菌及脱色路径研究进展

三苯基甲烷染料结构为一个碳原子连有3个苯环，不同染料的苯环上还带有不同的侧链基团。Nelson等人［10］在关于三苯基甲烷染料龙胆紫和结晶紫的生物毒性研究中发现:2种染料对中国大颊鼠类的CHO细胞和其它5种哺乳动物细胞的有丝分裂具有生物毒性。三苯基甲烷染料对生物细胞的致癌性和致突变性也被大量研究所证明，而能够对三苯基甲烷类染料进行初级脱色的微生物种类则多种多样，细菌、放线真菌以及藻类中不同的属种均发现有脱色菌株。20世纪80年代，Yatome等人［11］分离出能对甲基紫和结晶紫具有脱色能力的Psendomonaspseudomallei13NA，经检测其属于假单胞菌属菌株，同时采用TLC技术对甲基紫和结晶紫的降解产物进行分离，发现了某些未知产物。Yatome等人［12－13］在后期的研究中，利用TLC和GC－MS技术发现了结晶紫在枯草杆菌B．subtilisIF013719和放线菌N．corallina降解作用下的主要代谢产物均为4，4’－bisdimenthylaminobenzophenone和α－dimethylaminophenol。Chin－HungChen等人［14］在Shewanellasp．NTOU1厌氧降解结晶紫的研究中，同样检测出了上述2种产物。这说明细菌降解三苯基甲烷类染料过程的初步降解机理可能是相同的，见图2。

而对于三苯基甲烷类染料具有脱色效应的真菌，其脱色降解酶属于非特异性降解酶系，因此具有脱色效应的真菌多对三苯基甲烷类染料具有广泛脱色降解作用。而真菌中木质酶系对三苯基甲烷类染料的脱色，则主要是通过去甲基化过程实现的。1．3蒽醌染料降解菌及降解路径研究进展含有蒽醌结构或多环酮结构的染料称为蒽醌染料，染色具有色泽鲜艳、固色率高、染色牢度好等众多优点，但因为这种多芳环结构的高化学稳定性，使其更难降解。尽管蒽醌类染料的使用量仅次于偶氮染料，但目前关于蒽醌染料生物降解的脱色菌和脱色机理报道很少。

目前，如Bacillussubtilis、Pichiaanomala和Coriolusversucilor等部分微生物已被证明对蒽醌染料具有降解作用，并对蒽醌染料的降解路径进行了初步研究。许玫英等人［2］对脱色希瓦氏菌S12蒽醌染料脱色的研究结果表明:该菌株先与染料形成絮凝物，使水体中染料浓度迅速下降，再通过生物降解逐步实现染料的开环降解，该菌株的脱色关建酶属于组成型表达。SaadiaAndleeb等人［15］则利用高效液相色谱，对蒽醌染料的真菌降解产物进行了测定。而细菌生物降解蒽醌染料时，通常认为初始阶段通过未知还原酶的催化作用下还原裂解其共轭键，从而改变其结构。同时染料的脱色还原速率与其醌环取代基性质有很大关系，取代基的供电性越大，其脱色速率越快。王晓春等人［16］对4种蒽醌酸性染料的细菌脱色能力研究，验证了弱酸艳绿5G的脱色降解主要靠胞内酶的酶促作用。

2染料生物降解的脱色酶研究进展

2．1偶氮还原酶研究进展

厌氧条件下进行的偶氮还原反应过程的底物的专一性很低，多种还原性中间介质均能还原偶氮化合物。早期研究认为，细菌经由还原酶催化产生的黄素对偶氮染料进行非特性的还原断键，同时由于强极性的染料难以穿透细胞膜，因此细胞提取物对偶氮化合物的厌氧还原速率通常比完整细胞更快，这种机理模型认为黄素还原酶即是文献上泛指的偶氮还原酶。而另一种机理模型则认为细菌厌氧还原偶氮染料这一过程，并不需要偶氮染料或是还原黄素传递穿过细胞膜。Keck等人［17］在Sphingomonasxenopha-gaBN6的偶氮染料脱色机理研究中则发现，细胞中存在2套偶氮还原酶系统，一套是位于细胞质中的黄素氧化还原酶，还有一套是蒽醌类化合物(2，6－双磺酸蒽醌)，其在偶氮染料非特异性还原过程中，起到一种氧化还原介质的功能，该物质通过细胞膜上的蒽醌还原酶还原生成羟基蒽醌，从而还原基质中的偶氮染料。泛醌氧化还原酶AQS能显著提高细菌的厌氧偶氮还原率，但对细胞提取物影响不大，此反应机理如图3所示。

发现从肠道分离出的严格厌氧偶氮脱色菌的偶氮还原过程，不需要穿过细胞膜。NAM等人［19］则发现NADH在无偶氮还原酶存在的情况下，也可自身通过四电子方式将几种偶氮染料还原为相应的芳香胺。Run等人［20］从大肠杆菌中分离出一种NADH依赖性的lawsone还原酶，分析表明:lawsone还原酶就是氧不敏感的硝酸还原酶NfsB，在基质中添加lawsone能显著提高不同磺化偶氮染料的还原脱色效率。Maier等人［21］报道从芽孢杆菌SF中可提取出一种具有耐碱、耐热性的偶氮还原酶，属于NADH依赖性还原酶，厌氧条件下添加黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐(FAD)，可有效促进酶的脱色活性。许玫英等人［2］则对脱色希瓦氏菌S12的脱色酶位置进行测定，研究发现:S12T脱色酶属于组成型表达的胞内酶，不需要通过与底物接触而诱导产生。该酶位于细胞膜内，对分子氧本身并不敏感，但须在厌氧条件下才显示出脱色活性。细胞膜上脱色酶的脱色活性与FAD的量成正相关，加入NADH可进一步增强FAD对脱色酶活性的促进作用。

另外，近几年研究也发现了几种好氧偶氮还原酶，通过对其纯化、特征分析得到了它们的基因序列，对其序列分析表明，好氧偶氮还原酶之间不具有明显的同源性。表明，这几种蛋白质是按不同进化方式成为具有偶氮还原活性的酶，而好氧条件下偶氮键的代谢不能限制偶氮复合物的降解。对于好氧条件下的偶氮生物还原，基本认为是由特异性酶催化完成的。尽管在有氧条件下，一种好氧的偶氮还原酶能降解几种偶氮染料，但每一种酶对染料催化脱色具有不同的特异性。例如，从Xenophi-lusazovoransKF46F和PigmentiphagakullaeK24分别分离纯化得到的羧基橙Ⅰ偶氮还原酶和羧基橙Ⅱ偶氮还原酶，都是单体非黄素依赖性还原酶，并且NADPH是其最适辅助因子，但羧基橙Ⅰ还原偶氮酶要求偶氮键的β位上为羧基，而羧基橙Ⅱ偶氮还原酶则严格要求在偶氮键的α位上为羧基基团［4－5］。

2．2木质酶系脱色酶的研究进展

由于真菌脱色降解酶属于非特异性降解酶系，真菌多表现为对多种染料具有脱色效应，对染料具有广谱性降解作用。例如，黄孢原毛平革菌，其降解酶属于木质素降解体系。其降解过程中的关键氧化酶主要为LiP和MnP。对于大部分染料，LiP的降解机理主要为直接氧化导致C—C键断裂、芳香环开环、羧基化、苄基醇化、去甲基化、羟基化和二聚化等。LiP对染料的催化降解机理如图4所示。研究表明:LiP以VA为中间电子递体，VA是LiP酶合成诱导物，添加一定量VA可较大促进染料的脱色效应。MnP的降解机理与LiP类似，也产生2种酶的中间体MnPⅠ和MnPⅡ，而MnP以Mn2+为中间电子递体［22］。Bonnarnle等人［23］研究表明:Mn2+对MnP合成起调节作用，基质中不添加Mn2+，MnP几乎不合成，而Mn2+浓度在0～40mg/L间时，浓度越高越利于MnP的合成。由于这2种过氧化物酶只提供电子的转移而不是直接与化合物结合，从而使该类菌具有广泛的脱色降解作用，而且不易受化合污染物的毒性影响。研究证明:木质酶系中的漆酶也对染料具有广泛的脱色作用，其为一种以O2为电子受体的含铜蛋白质，能经4次单电子传递催化多酚化合物，形成醌和自由基，再以链式反应传递自由基以氧化底物，从而使染料脱色［22］。同时研究还证明，在基质中添加一定的小分子氧化还原介体，有助于漆酶的催化脱色作用［24］。

2．3脱色还原酶TMR的研究进展

Moon－SunJang等人［25］从对三苯基甲烷类染料具有脱色效应的Citrobactersp．strainKCTC18061P中分离纯化出还原酶TMR，经分析该酶由2个31kDa分子质量的亚基组成的同型二聚体。还原酶TMR为NAD(P)H依赖型还原酶且具有底物特异性，并在60℃和pH值9．0条件下酶催化活性最大。根据紫外－可见光谱分析和薄层色谱法测定，TMR是通过去甲基化反应催化三苯基甲烷类染料脱色，因此对于无烷基侧链的三苯基甲烷类染料不具有催化活性。对还原酶的氨基酸序列进行分析发现，该酶的N端序列与NAD(P)H依赖型酶具有很高的同源性，即包含有核苷酸结合基序“GXXGXXG”。同时研究还发现，将序列中的3个甘氨酸分别用丙氨酸替代，酶促脱色效率均有不同程度的降低，说明这3个甘氨酸在酶与底物和辅酶的结合上均具有不同作用，并都与酶活相关。

2．4其它脱色酶的研究进展

除上述脱色酶外，SeongJunKim等人［26］研究还发现了一种糖蛋白的过氧化酶(DyP)，其对21种不同类型染料中的9种染料(主要为蒽醌类颜料)具有脱色效应，同时2，6－二甲氧基和愈创木酚可作为DyP合成的诱导物。另外，从小鼠肝脏微粒体中提取的细胞色素P450单氧加氢酶，对染料也具有脱色作用，其催化过程可被CO和甲吡酮所抑制。研究发现:甲吡酮能抑制部分真菌对三苯甲基类染料的脱色效应［27］，因此，细胞色素P450单氧加氢酶也可能参与了真菌的脱色作用。任随周等人［28］从嗜水性单胞菌DN322中分离纯化出一种对三苯基甲烷类染料具有高效脱色效应的NAD(P)H依赖型氧化酶，命名为TpmD，研究发现，甲吡酮及维生素C(VC)对该酶活性具有明显抑制作用。张培培等人［29］对有机溶剂和抑制剂对TpmD酶活的影响进行了进一步研究，结果表明:乙醇、丙酮和SDS均会使TpmD的酶活迅速丧失，而低浓度(＜10%)的二甲基亚砜则有利于重组酶活性的维持，同时研究还发现二硫苏糖醇(DDT)可取代NADH作为TpmD的辅酶，并且催化脱色效率有明显提高，而脱色产物的全谱扫描分析表明，DDT辅助TpmD酶促脱色机理与NADH作为辅酶的机理表观是完全不同的，氧化酶TpmD的脱色机理有待进一步研究。

3皮革染料生物降解性研究展望

随着绿色化学的理念成功引入皮革化学品的分子设计中，近几年对于各类皮革化学品结构与生物降解性相关性的研究开始增加。染料作为制革废水中主要难降解有机污染物之一，对其生物降解性能的研究也是重点工作之一。张文军等人［30］对5种皮革常用染料的好氧生物降解性能进行了研究，结果表明:好氧条件下活性污泥对5种染料的脱色效应较低，主要依赖菌胶体的吸附作用。染料及其降解中间体多不能被生物好氧降解，但在厌氧条件下却能被降解或部分降解，并改变其分子结构，使其成为易于好氧生物降解的有机物。因此，对于皮革染料而言，应主要集中于厌氧条件下的生物降解性能研究，探索染料结构与厌氧降解效应的一般关系。

同时，染料生物降解效率较低，一方面是因为微生物较难以其为唯一碳源进行生长，另一方面则因为单基质中缺乏脱色酶的诱导物，因此，基质的组分对染料生物降解的影响较大。皮革行业应侧重于基质对染料生物降解的影响效应研究，并结合自身工业废水特点，寻找有利于染色废水脱色的共基质降解物质。例如，制革生产过程中，复鞣染色加脂工序通常是同浴进行，而加脂剂作为易降解物质，可为染料降解菌的生长提供有效的碳源和能源，同时，加脂剂的降解过程可快速消耗水体中的溶解氧，从而形成厌氧的微环境促进染料的厌氧脱色。另外，乳化成分则可促进水体底部的气质传递，本课题组前期试验研究已证明:氧化－亚硫酸化牛蹄油在静置培养下，对酸性品红和酸性大红的生物脱色具有明显效用，其促进机理仍需进一步研究。复鞣工序中常用的植物鞣剂和苯磺酸类合成鞣制，其生物降解过程中所产生的部分中间体，可诱导真菌过氧化酶的产生，从而具有提高制革染色废水生物脱色效率的可能性。