皮革与胶原等电点的测定方式

本文作者：程海明、陈敏、李志强 单位：四川大学制革清洁技术国家工程实验室

等电点(IsoelectricPoint，PI)是两性电解质的特征物理参数。两性电解质在电场中不发生迁移时其溶液或悬浮液所处的pH值为该两性电解质的等电点［1］。此外还有另外一些对等电点的定义，如Michaelis［2］将等电点定义为溶液中两性电解质的正离子与负离子的数量相等时氢离子的浓度。Sorens-en等［3］对等电点的定义则是溶液中两性电解质的平均价态为零时的氢离子浓度。这些定义都与电泳时两性电解质的零位移相一致。对于固体材料，如陶瓷或皮革，其表面有不同的极性基团，这类材料的等电点被规定为当物体表面不带有净电荷时的pH值［4］。

蛋白质是一种典型的聚两性电解质。蛋白质肽链的两端有游离的氨基和羧基，侧链上更带有若干酸性基团和碱性基团，这些基团都具有放出或接受质子的性质，当蛋白质溶液的pH值达到某一特定值时，蛋白质分子不带净电荷，此时的pH值即为蛋白质的等电点。不同的蛋白质由于所带酸性和碱性基团不等，而等电点不同［5，6］。等电点特性是蛋白质极其重要的性质，对蛋白的分离、纯化和分析等都具有重要的实用价值［7］。

1胶原及皮革等电点及其与制革的关系

作为动物皮制革的对象，是由胶原蛋白聚集而成的胶原纤维束编织而成，胶原蛋白和由其聚集而成的胶原纤维皆具有一定的等电点。对天然胶原等电点的认识经历了较长的一段时间，这是因为在最初的研究过程中所使用的样品为经过碱处理之后的皮粉，现在我们知道天然胶原的等电点在6．5～7．8［8］。制革过程中由于酸、碱、盐以及鞣剂的作用，天然胶原的等电点会随着处理条件的不同而发生不同的改变。如，用碱法制得的明胶其等电点为4．7～5．2，酸法制得的明胶等电点在7～9左右［8］。在浸灰过程中，碱能促使胶原主链或支链上酰胺键水解，产生游离的羧基而氮原子以氨气的形式挥发出来，从而导致胶原分子中的羧基数量相对增大，进而使得胶原和裸皮表面的等电点向低pH值的区域偏移［9］。胶原蛋白的等电点及其在制革过程中发生的变化对制革工艺的制定很重要。制革的很多工序的工艺是根据皮胶原所处的等电点来进行设计的。

制革操作过程中的特定pH值使得皮胶原带有正、负或不带电荷，从而实现皮胶原与相应的皮革化学品发生反应，达到制革的目的。例如，脱灰、软化后裸皮的pH值约在7．5～8．5之间，而裸皮的等电点在pH值5左右，此时裸皮仍处于碱性状态。如果脱灰、软化后进行铬鞣，裸皮的pH值显得高了，铬鞣剂将在裸皮表面富集，难以渗透至皮纤维内部，有产生过鞣的危险。裸皮的浸酸就可以脱去软化后的裸皮中剩余的碱，以实现裸皮pH值的继续下降，保证铬鞣的需要［10］。

鞣剂与胶原纤维作用前后，皮革的等电点将发生较大的变化。如浸酸裸皮的等电点为5．5左右，而铬鞣后皮革的等电点变为7．0左右，植鞣后皮革的等电点变为3．2～4．0［11］。鞣剂鞣制后皮革的等电点发生变化，可能是因为鞣剂与皮胶原分子某些带电荷的基团发生了结合，而使这些基团封闭不能离解。因此，可以根据等电点的变化情况了解胶原分子上有多少这样的基团与鞣剂发生了反应，这些基团的性质如何等等信息，为揭示制革化学中关键的鞣制机理问题提供重要线索。

目前关于皮革及胶原等电点这一基础数据仍较混乱，不同等电点的表征方法所得数据相互之间缺乏可比性，下文将对目前表征胶原及皮革等电点的方法进行综述。

2可溶性胶原及其降解物的等电点表征方法

蛋白质的等电点可以通过实验测定，也可以根据其氨基酸组成进行理论计算得出。可溶性胶原及其降解物等电点的表征方法进行总结如下。

2．1实验测定

根据等电点的定义，可以用电泳方法来直接表征可溶性蛋白的等电点，但大多数研究的胶原及明胶的等电状态是利用其物理性能和化学活性在等电点时发生巨大的改变而获得。如:黏度最小、膨胀度最小、渗透压最低、电导率最小、浊度最大等。当用这些测定的数据对pH值作图，在邻近或等电点处曲线都有一个剧烈的下降或倾斜。以下对一些常用的测定等电点的方法分别进行介绍。

黏度法［12］:明胶稀溶液的黏度随溶液pH值改变而发生变化，是由于明胶分子带电而使其产生变形的结果。在等电点附近时，明胶分子为电中性，分子收缩，所以黏度最低;当偏离等电点使pH升高或降低时，黏度都增加，这是由于明胶分子的净电荷随pH变化而增加，静电排斥力使得明胶分子链展开的缘故。例如配制一定浓度的明胶溶液，在不同pH值条件下用毛细管黏度计，通常为奥氏黏度计测定其相对黏度，将所得的各pH值条件下的相对黏度对pH作图，找到最低相对黏度时的pH值，此pH值即为明胶的等电点。乙醇

沉淀法［13］:明胶易溶于水，即使处于等电点附近仍能溶解成为均匀的明胶水溶液，但当加入沉淀剂无水乙醇时，即产生明显易见的白色沉淀。乙醇沉淀法的原理是明胶溶液产生白色沉淀所需的无水乙醇耗用量，在处于等电点时出现极小值，以此来确定明胶的等电点。不同pH值的明胶溶液各取5mL置于比色管中，加水5mL，摇匀，向试样溶液中逐滴加入无水乙醇直至出现可见的白色沉液为止。记录胶液的pH与所耗用的无水乙醇毫升数，绘制乙醇消耗毫升数－pH值关系曲线，取最低点对应的pH值即为明胶等电点。

乳光法［13］:在较低温度时，溶液浓度不低于0．5%的情况下，若介质pH在等电点附近，明胶大分子会发生暂时的絮凝。这是因为，等电点时明胶大分子中正、负离子数相等，分子链构象呈最卷曲状态，形成具有定向排列的复合胶团点阵，通过胶团表面间的侧基及氢键相互连接、聚集，而处于准絮凝状态．当光线入射时出现乳白色散射光。配制一组浓度相同而pH范围在3～7之间，相邻两试样的pH差为0．2～0．3的明胶溶液，等体积吸取各试样溶液于比色管中，放于冰水浴中冷却使其凝冻，取乳白光最强者的pH值为试样的等电点。

滴定法:刘白玲等［14］将酶法提取的猪皮胶原重新溶解在0．5mol/L的醋酸中，得澄清溶液，以6mol/LNaOH滴定，直至胶原溶液出现沉淀，且沉淀不再溶解，测定此时的pH，重复测定3次，取平均值，即为该胶原的等电点。用该方法测得胃蛋白酶提取的猪皮胶原其等电点为4．98。王碧等［15］配制一定浓度的不同胶原蛋白及多肽溶液，分别用标准氢氧化钠溶液滴定，绘制电位滴定曲线，并做一次微商曲线，确定各胶原蛋白及多肽溶液的滴定终点。进而确定氨基(NH2－)和羧基(－COOH)的表观平衡常数K1和K2，据此求得各样品的等电点pI=(pKl+pK2)/2。

荧光法［16］:有实验表明，在一定的pH值范围内，明胶的荧光强度与其黏度之间应呈现相反的变化趋势，所以测出不同pH值下一定浓度的明胶溶液的荧光强度，并测出对应的黏度值，荧光强度最大处和黏度最小处应对应于同一pH值，此pH值即为该明胶的等电点。

等电聚焦法［17］:等电聚焦(IEF)是一种高分辨率的蛋白质分离分析技术，它是利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点的不同，在一个稳定连续的、线性pH梯度中进行蛋白质的分离。氨基酸侧链在不同的pH环境中所带电荷不同，在蛋白质处于等电点时，它的净电荷为零，在电场中也就停止了泳动。因此可通过测定其净电荷为零时所处的环境pH值而测定出该蛋白的等电点。等电聚焦的实施方法可以是园盘电泳，平板电泳以及毛细管电泳，其关键点是需要在凝胶中形成连续稳定的线性pH梯度，这需要在凝胶中添加一定的载体两性电解质实现。

其它鞣剂鞣制研究方面，郭文宇等［18］使用等电聚焦法测定了不同鞣剂鞣制明胶溶液的等电点。各鞣剂对明胶处理后等电点的变化可以看出，膦盐鞣制体系不同于铬鞣以及单独的醛鞣体系。采用膦盐鞣制后皮胶原的等电点先下降后升高，而甲醛作用后明胶的等电点随着甲醛的用量的增大而逐渐降低，铬鞣过后明胶的等电点逐渐升高至6．5左右。

从等电点的定义出发，可知采用等电聚焦法进行等电点的测定，所得结果精确性较高，但等电聚焦方法过程复杂，需要标准的pI两性电解质，实验过程中需要防止对流扩散，而且对样品有一些特殊要求。其它实验方法实施起来相对简单，但存在误差较大的问题。由于蛋白质各种物理性质的不同，使得不同方法测定的等电点在数值上存在差异，可能也是胶原等电点这一基本数据一直以来众说纷纭的根源所在。

2．2理论计算

蛋白质都具有特定的氨基酸组成和排列。考察蛋白质等电点可以根据其氨基酸组成，将碱性氨基酸和酸性氨基酸残基的pKb和pKa值分别找出，然后进行理论计算，可以得到该蛋白质的理论等电点。将理论计算得出的等电点与实验测定得数值进行比较可以揭示蛋白质分子间的相互作用和构象特征等信息［19］。最近有很多这一方面的文献报到［19－23］。蛋白质等电点理论计算的理论基础是计算pH梯度的Henderson-Hasselbalch方程［20］。pH=pKa+log(［A－］/［HA］)(1)蛋白质处在等电点时，其分子中带正电荷的基团总数与带负电荷的基团总数相等，方程可以表示为:ΣiAi/［1+10(pKAi–pI)］=ΣiBi/［1+10(pI–pKBi)］(2)等式的左边为酸性基团的加和，右边为碱性基团的加和。

组成蛋白质的20种氨基酸中，其中有7种是酸性或碱性氨基酸，再加上蛋白质两端未参与成键的氨基和羧基，使得需要用9个电离常数来描述蛋白质氢离子的电离平衡。即便这9个电离常数不受介质环境的影响，计算过程也已相当复杂，从而有了各种近似和模拟计算方法［20－23］。

根据其中主要的酸性基团和碱性基团，离解常数可减少到2个即一个酸性离解常数，一个碱性离解常数。简化之后就可以推导出等电点与这两个离解常数以及酸性基团和碱性基团摩尔比之间的表达式。Sillero等［20－21］采用摆动方法(oscillatingmethod)，Patrick-ios和Yamasaki［23］利用非线性回归方法，对多肽和蛋白质等电点的计算进行简化。他们根据蛋白质酸性基团与碱性基团的比例，分成三种情况，一种是酸性基团远远多于碱性基团(R1)，一种是碱性基团远远多于酸性基团(R1)，还有一种即为两者数量相近(R→1)。pI=pKa－logR当R1时;pI=pKb－logR当R1时;pI=(pKa+pKb)/2+10［(pKb–pKa)/2］×(1－R)/(2ln10)当R→1时;(3)对这些数值进行非线性回归分析。通过对58种已知氨基酸组成的蛋白质的等电点的计算，发现当取pKa=4．9、pKb=10．0时，所得等电点的值与电泳方法测定的值其平均绝对偏差为0．7个pH单位，这一结果与采用不简化方程的计算结果相当吻合。根据氨基酸组成来进行理论预测蛋白质的等电点没有普遍适用的方法，因为等电点与氨基酸组成之间的关系复杂，带电基团在微环境中电离行为也有很大影响。各电离常数的值对蛋白所处微环境的依赖性使得问题相当复杂。这些微环境的影响由相邻或较远的氨基酸残基间存在的分子内静电引力和疏水作用力导致。对这些作用力进行估算的困难被加重除了与蛋白质肽链氨基酸残基序列有关而外，还与氨基酸残基在三维空间内的折叠蛋白质构象的相对位置有关。

胶原蛋白由于其特征的三螺旋结构，笔者认为要对胶原及其降解物等电点进行相对精确的理论预测，需要考虑胶原特殊的空间螺旋结构对各基团电离常数的影响。

3不溶于水的胶原纤维、皮及皮革等电点表征方法

以上等电点的实验测定方法均要求所测试样在水中能够溶解，对难溶于水的一类蛋白及其他两性物质的等电点的测定，实施起来难度就大得多。天然胶原蛋白在水中的溶解性能很差，从动物组织制得的固相胶原纤维要再次溶于水中，溶解度更低。制革过程中的裸皮及半成品均是不溶于水的块状固体，为了制革工艺的科学设计和顺利实施，需要测定这些处于固态的裸皮或半成品的等电点。

前人对皮革等电点的表征采用的方法有染色法、滴定曲线法以及等电聚焦法等［1］。对于不溶于水的胶原纤维而言，采用等电聚焦法实施起来有一定的困难，需要以悬浮液来进行电泳，并要求电泳过程中悬浮液中的颗粒不沉降。

Kelly将染料染色方法引入来测定胶原的等电点［24］。该方法的原理是，胶原在偏酸性时与酸性染料结合，而碱性染料与胶原具有亲和力仅在偏碱性条件下。如当皮粉(浸灰、脱灰处理胶原)的pH值低于5时，发现黄色的酸性染料与其结合，当皮粉的pH值高于5时，红色的碱性染料与其结合。所以得出皮粉的等电点为5。用于这一方法的染料需要选择相对简单的化合物，与皮胶原只用染料分子中简单的离子基团相结合。而对较复杂组分的染料，含有配位活性的基团，离子反应不具备相对的选择性。

Staverman用测量电解电动势来表征由豆蛋白、压紧的皮粉所制成的膜的等电点，或剖层皮的等电点［8］。在原电池中，剖层皮作为膜，将浓度分别为0．1mol/L和0．01mol/L两种浓度的KCl溶液隔开，用甘汞电极测量两个半电池的电势差。为表征膜的等电点，原电池中注满已知pH值的适量的缓冲溶液，使缓冲体系的pH值在该膜的等电点附近，以电势差对pH作图，曲线在X轴上的交点即为其等电点。

在铬鞣机理的研究过程当中，用染色技术测定胶原分别经阳离子铬配合物和阴离子铬配合物作用后等电点的变化［25］。结果显示，铬鞣前的皮粉的等电点在pH值5．5处，经阳离子铬配合物鞣制后等电点升高到6．5～7．5，经阴离子铬配合物鞣制后等电点降低到4．0～4．5。这一结果揭示阳离子铬配合物主要与胶原的酸性基团反应，而阴离子铬配合物与胶原的碱性基团反应。充分研究阳离子和阴离子铬配合物与胶原等电点的关系之后，结果指出阳离子铬配合物降低了胶原阴离子基团的活性，主要是胶原上的羧基与其反应;胶原的阳离子基团与阴离子铬配合物反应而使其活性降低。

4展望

至今，可溶性胶原及其降解物等电点的精确测量仍是以等电聚焦电泳方法最佳，如何改进等电聚焦电泳方法的精确性是一个发展方向。毛细管等电聚焦［26］、固相pH梯度等电聚焦［27］等对提高等电聚焦方法的精确性至关重要。固相pH梯度等电聚焦比传统的等电聚焦具有更高的分辨率，其分辨率可达0．001pH。

对胶体溶液中粒子的等电点，有人通过测定其zeta电位的变化来表征［28］，在zeta电位为零时胶体溶液的pH值，即为胶质的等电点，而胶原蛋白溶液即是典型的胶体溶液，从而可以用此方法来表征胶原蛋白的等电点。程海明等［29］用zeta点位滴定法对胶原及明胶溶液的等电点进行了测定，当zeta点位值为0时的pH为胶原的等电点，并将该方法与等点聚焦法进行了比较。结果表明，用zeta电位滴定法所得胶原等电点值在7．5左右，该值与等电聚焦法所得结果非常接近。另外对金属氧化物膜表面的等电点，有人采用了测定其不同pH值条件下的接触角来表征［30］，其原理是当该膜处在等电点的pH值时，其接触角最大。通过测定不同pH值条件下的接触角，找到最大值时的pH值，即为该金属氧化物表面的等电点。此方法有望作为皮革或其他两性织物表面等电点的测定方法。

总之，对胶原及皮革等电点的表征方法仍然需要进行深入的研究，以获得更为精确的基础数据。胶原及皮革等电点的研究对制革工艺的制定有重要的指导意义;此外，也对了解胶原分子与鞣剂的相互作用有重要作用，对揭示各种鞣剂的鞣革机理有一定的贡献。