转基因水稻土壤跳虫群落

水稻是我国主要的粮食作物之一，2009年11月27日中国通过了对转Bt抗虫水稻的生物安全认证，这一举措具有里程碑意义，对转基因作物在中国、亚洲乃至全世界的应用产生重大影响。转Bt基因抗虫水稻因其自身能合成杀虫蛋白，从而有效地降低了农药施用量，展现出广泛的应用前景。但是，随着转Bt基因抗虫作物大面积商品化推广使用，使得大量外源杀虫蛋白以植株残体、根系分泌物或花粉等形式进入土壤环境，进而延长土壤生物与转基因代谢产物的接触时间［1］。虽然Bt蛋白在短期内对土栖动物无负面作用，但由于外源Bt蛋白的杀虫特性不同，以及复合基因代谢产物在土壤中的降解及其与土壤腐殖质酸、蒙脱石或铝羟基等的聚合物多样，进而对土壤生物产生诸多直接或间接的不确定性影响［2］，这也是转基因作物生态风险评估亟待明确的问题。

跳虫是一类广泛分布的小型节肢动物，大多喜好阴凉潮湿的土壤环境以及地表枯枝落叶层等。跳虫种类和数量极其丰富，与线虫和螨类一样是土壤生态系统中的主要功能类群，，并参与物质的分解［3-4］。跳虫对土壤环境污染十分敏感，能敏感指示土壤环境的变化程度［5-7］。国外常用来开展土壤污染的生态风险评价，如利用土壤跳虫的丰富度和多样性等来开展污染物对土壤环境的影响评估［8］，利用土壤跳虫的死亡率、繁殖率、生物富集以及行为效应等作为评估被污染土壤修复成功与否的生物标志物等［9-12］。Al-Deeb等［13］对转Cry3Bb基因棉田土壤弹尾虫的调查结果显示，转基因棉田和亲本对照棉田的弹尾虫数量没有差异。国内，应用土壤动物进行土壤生态风险评价的研究很少，仅见于转Bt基因作物的环境风险研究，如Yu等［14］报道转Cry1Ab和转Cry1Ac基因棉花以及转CryⅢ基因马铃薯的外源Bt毒蛋白对土栖弹尾虫Folsomiacandida和奥甲螨Oppianitens无显著影响。白耀宇等［15］研究指出生活在转Bt水稻残体环境中的跳虫体内检测有微量Bt杀虫蛋白，但这对跳虫的发生量并无不良影响，相反，转Bt水稻稻田中跳虫数量反而显著高于对照亲本田。

与室内试验研究相比，大田试验研究是在开放的野外环境下进行的，因此，研究结果更具实用性，并能切实反映实际情况。目前，在大田层次上进行的转基因植物安全性研究报道较少，Wolfenbarger等［16］认为转基因植物对非目标生物的影响取决于作物被改造的特征及其与生态系统其它部分复杂的关系。因此，大田环境下转基因水稻的安全性是目前急需解决的问题。本研究选取不同基因型(Cry1Abvs．Cry1Ab+Cry1Ac)和不同类型(恢复系和杂交系)的转Bt水稻为研究材料，开展稻田土壤跳虫群落组成及数量动态研究，以进一步明确转Bt作物的土壤环境安全性。

1材料与方法

1．1供试转Bt水稻、

试验所用转Bt水稻为3个转Cry1A抗虫水稻品系及其对照亲本，包括:转Bt水稻恢复系“克螟稻”(Cry1Ab纯合基因型;简称KMD)及其亲本“秀水11”(简称XSD)，稻种由浙江大学原子能研究所提供;转Bt水稻恢复系“华恢1号”(Cry1Ab+CryAc融合基因型;简称HH1)及其亲本“明恢63”(简称MH63)，转Bt水稻杂交系“Bt汕优63”(Cry1Ab+CryAc融合基因型;简称Bt-SY63)及其对照亲本“汕优63”(简称SY63)，稻种均由华中农业大学植物科技学院提供。

1．2试验地布局及耕种

试验地设在山东省宁津县南京农业大学植物保护学院气候变化创新研究基地(37．64°N，116．8°E)。试验地由面积相等的6块相邻样地组成，KMD与XSD、HH1与MH63、Bt-SY63与SY63各东西向两块相邻样地，转基因及其对照亲本由西向东排列，3个水稻品系自南往北依次排列，这样由南向北，前两个水稻品系为恢复系的纯和基因型和融合基因型，后两个品系为融合基因型的恢复系和杂交系;每样地划分为4个小区，每小区5m×20m，且小区东西向和南北向玉米隔离带均为5m。水稻于5月15日旱作直播，播种前按每亩50kg氮肥、30kg磷肥和20kg钾肥施底肥，大田漫灌1次，并于水稻拔节期和孕穗期分别追施N肥(20kg/666．7m2)、P肥(12kg/666．7m2)和K肥(8kg)各1次;此外，播种后间隔3周人工除草和灌溉各1次。

1．3土壤取样、跳虫分离及其鉴定

自水稻播种后一个月，即6月11日开始，每30d进行一次土壤采样，试验于11月8日结束，共采样6次。采样时，用100mL环刀按照品种顺序逐个小区(重复)进行，每小区按S形取样方法取6环刀，每2环刀随机放入一自封袋中，做好标记后带回实验室分别进行分离鉴定。土壤跳虫的分离采用Tullgren干漏斗法，干漏斗上部为40W灯泡，干漏斗中部为金属网筛，网眼2mm，干漏斗下部用装有浓度为75%酒精的白色塑料小瓶收集跳虫［17］。将带回的每个土样混匀后，用100mL标准环刀量取一环刀(即100mL)土样置于干漏斗上，每次分离时间为48h。将分离得到的跳虫按土样标号分别用酒精清洗，然后用霍式封固液封片，玻片做好标号后置于50—60℃的烘箱中干燥1周，使虫体透明、肢体展开，以便进行分类鉴定。土壤跳虫鉴定由中国科学院动物所担任，鉴定到属，同时记录跳虫数量，转化为每平方米土壤跳虫数量，并进一步统计跳虫类群的多样性(H')、种类丰富度(SR)和均匀度(J)等指数［18］。此外，按照殷秀琴等［19］的方法，将土壤跳虫划分为优势类群(即个体数占总捕获量10%以上者)、常见类群(即个体数占总捕获量1%—10%者)和稀有类群(即个体数占总捕获量1%以下者)。同时，按照其活动位置，将土壤跳虫划分为土上生(地表活动)、真土生(土下活动)和半土生(地上地下活动)三类(表1)。

1．4统计分析

用SPSS16．0统计软件进行试验数据的分析。对6月11—11月8日期间，共计6次采样的数据采用“双因子重复测量方差分析”(即Two-wayRepeatedTimeANOVA)，分别比较2对恢复系的不同基因型(Cry1Ab纯合基因型KMDvs．Cry1Ab+Cry1Ac融合基因型HH1)或Cry1Ab+Cry1Ac融合基因型的2对育种品系(即恢复系HH1和杂交系Bt-SY63)转Bt水稻及其对照亲本大田土壤跳虫不同类群百分比组成、密度、多样性指数、种类丰富度和均匀性指数的差异。并进一步通过“群体成对T检验”(即Group-pairedTtest)统计分析调查期间转Bt水稻及其对照亲本间，以及不同水稻品种、不同功能群间以上指标数量动态的显著性差异(P＜0．05)。数据分析前，对绝对值数据进行对数转换，对百分比数据进行反正弦平方根转化，以符合正态分布假设。