反硝化测定方法

反硝化作用是生态系统氮循环过程中一个重要的组成部分，能够导致农田土壤氮素损失，降低土壤肥力，促进温室气体N2O排放。但是从生态学的角度考虑，反硝化作用能够把生态系统固定的氮和人为活化氮以N2的形态返回到大气氮库中，是活性氮最终以惰性氮离开土壤、水体等内部生物循环而回到大气的唯一自然途径[1]。因此，反硝化过程能够去除水体中的硝态氮，调节水体质量，平衡生物固氮输入通量，减少活性氮对环境和气候变化的影响。虽然有关反硝化的研究已经取得了很大进展，但是迄今为止仍然没有一种合适的方法来量化反硝化速率[2]，主要原因有：（1）大气和水体中氮气的环境背景值很高，从而使得测定反硝化产生的微量氮气存在很大困难；（2）反硝化过程具有很大的时空变异性；（3）目前所采用的方法大都是改变了底物浓度，或者破坏了样品的物理环境，从而不能获得真实的反硝化速率；（4）不同研究者在反硝化测定方法上缺乏交流，从而阻碍了反硝化的研究进展。因此，本文综述了目前在陆地和水体生态系统中几种常用的测定反硝化速率的方法，并针对这些方法的优缺点进行讨论，以期为今后反硝化测定方法的进一步研究提供参考。

1目前常用的反硝化测定方法

1.1乙炔抑制法

采用乙炔抑制法来研究反硝化是基于高浓度乙炔能够抑制硝化作用以及N2O向N2的还原[3]，从而使得N2O成为反硝化的终产物。由于N2O在大气中的浓度很低，因此很容易测得N2O的产生量，从而间接推算出反硝化速率。乙炔抑制法主要包括箱法和土柱方法。最早使用的乙炔抑制法是向原位箱下的土壤中灌注乙炔[4,5]，但是这种方法费力，难于操作。基于这个缺点，研究者们开始采用土柱方法。土柱法包括动态土柱法和静态土柱法，所谓动态土柱法是指使用通气泵促使乙炔和土壤空气在土壤大孔隙中循环，然后在2小时之内连续测定N2O的浓度变化以计算反硝化速率[6]。但是由于气体是采用强制泵入的方式，容易导致土柱中压力的变化，进而破坏土壤结构、影响气体扩散。静态土柱法则是把乙炔注入到一个密封的容器中，经过一定时间均衡后测定N2O的积累速率[7]。与动态土柱法相比，静态土柱法不存在气体循环过程，并可进行大量样品测定，但是乙炔扩散进入土柱以及N2O扩散出土柱都有一定的限度[8]。用乙炔抑制法测定反硝化速率操作简单便捷，成本低，可以进行大批量样品的同时测定。其主要不足之处是乙炔抑制了硝化作用，当NO3-成为反硝化的限制因子时，将低估反硝化损失量[9]，从而影响测定结果的准确度。此外还存在一些其它问题：（1）在粘土或者饱和沉积物中，乙炔扩散速率很慢，对硝化作用抑制不完全[10]；（2）长期反复使用乙炔会导致反硝化微生物对乙炔的适应，将乙炔作为一种碳源，消耗乙炔，从而导致浓度降低，抑制效果下降[11]；（3）在土壤碳含量较高而NO3-浓度较低时（<10μmolL-1）可能促进N2O的还原而削弱乙炔的抑制效果[11,12]；（4）乙炔中的杂质气体（如丙酮）会影响反硝化过程[13]。最近还有研究表明，在有氧气存在的情况下，高浓度乙炔（大于0.1kPa）会促进反硝化产生的NO分解或者催化NO的氧化，从而低估反硝化速率[14]。虽然乙炔抑制法存在很多问题，但由于迄今为止还没有一个令人十分满意的测定反硝化的方法，所以这种方法仍被广泛使用[2]。如目前对于反硝化潜势和反硝化酶活性的测定，普遍采用的都是乙炔抑制法[13]。低浓度乙炔能够抑制硝化作用，高浓度乙炔不仅能抑制硝化作用，还能抑制反硝化作用过程中N2O向N2的还原。因此，Kester等[15]通过向土壤中添加不同浓度的乙炔，量化了林地、草地、河水底泥中硝化作用和反硝化作用对N2O排放的贡献。Ullah[16]采用乙炔抑制法研究了农业流域内不同利用类型土壤的反硝化能力及其影响因素，并估算了反硝化作用对流域内硝态氮的去除能力。虽然这种方法可能低估了反硝化能力，但仍使人们认识到了反硝化作用对于去除活性氮的重要作用。

1.215N同位素示踪法

同位素示踪法包括15N平衡差值法和15N示踪气体直接测量法。15N平衡差值法是基于微区试验中不存在径流损失，氮的当季淋洗损失又极低，而把所有的氮素损失都作为气态损失的基础上建立的。廖先苓等[17]把从15N微区试验中测得的氮素总损失量扣除氨挥发损失量后作为硝化-反硝化损失量，其优点是15N的丰度和氨挥发量可准确测定，其主要缺点是测定结果是硝化和反硝化的共同气态损失，不能区分两个过程对氮转化的具体贡献[18]。此外，李振高等认为[19]微区施入的15N与土壤原有15N进行交换，土壤中气体逸出受阻使测定值偏低，再加上氮总损失量、氨挥发量等各个环节的测定，使得最终的测定误差很大。15N示踪气体直接测量法是向土壤中添加15N标记的NO3-，然后测定产生的N2和N2O的15N来量化土壤的反硝化速率[20]。这种方法出现于50年代末，80年代广泛应用于旱地，近年来才被用于测定稻田土壤和沉积物的反硝化损失。Petersen[21]向原状沉积物柱样中分别加入15NO3-和15NO2-，通过测定15N2的量，不仅计算出反硝化速率，而且还量化了厌氧铵氧化对N2排放量的贡献，并指出沉积物中铵态氮硝化产生的NO3-是反硝化的主要氮源。虽然15N示踪气体直接测量法也存在气体扩散受阻、标记不均匀等缺点，但因其具有较高的灵敏度使得此种方法仍然得到了广泛应用并推动了反硝化过程的研究。使用15N同位素示踪技术是建立在假定施入到土壤中的15N能够和土壤本底15N快速均匀混合的基础上。理论上讲，由于土壤结构不均一、存在扩散障碍物、生物扰动、同位素分馏等因素使得在静态土柱中很难达到这种快速均匀混合的状态。但Steingruber等认为[22]，同位素的非均匀混合对反硝化测定结果的影响很小，所导致的误差不超过10%。其他研究表明[23]，即使土壤中的NO3--N标记是不均匀的，仍能对反硝化产生的N2作出准确的估计，因为非均匀混合所导致的误差可能远远小于实验系统误差。值得注意的是，有报道指出土壤微生物倾向于利用轻质同位素，从而使得该方法低估了反硝化的发生程度[19]。此外，向氮源缺乏的生态系统中添加15N标记的NH4+、NO3-可能会增加可利用的氮源，从而高估反硝化速率，因此这种方法最好用在氮素含量较高的生态系统中[23]。

1.3N2直接量化法