维氏气单胞菌致病性与耐药性

维氏气单胞菌隶属弧菌科(Vibrionaceae)气单胞菌属(Aeromonas)，为革兰阴性杆菌，兼性厌氧型。气单胞菌广泛存在于各种水体生态系统中，比如淡水、沿海水域以及污水中［1］，能够经常从腹泻的人类［2］以及出血性败血症的鱼类中分离到［3］。研究表明，嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌以及维氏气单胞菌为3种主要的致病性气单胞菌，涵盖了气单胞菌中85%的临床病症来源［4］。目前在水产动物养殖上，对于气单胞菌致病性的研究主要为嗜水气单胞菌［5］，对维氏气单胞菌的致病性及分布关注并不多。团头鲂(MegalobramaamblycephalaYih)隶属硬骨鱼纲鲤形目鲤科鳊亚科，是我国重要的草食性经济鱼类之一，具有味美、生长快、抗病力强等特点，是江苏省南部地区的主要淡水养殖品种。出血病是团头鲂养殖过程中危害最严重、造成经济损失最大的病害，通常认为由嗜水气单胞菌引起［6］，使用抗生素进行防治［7］。然而，随着养殖密度的扩大、养殖水体的恶化以及抗生素的滥用，团头鲂出血病呈常发、难治的态势。本研究在江苏省常州市武进区某团头鲂养殖塘刚刚出现出血病后，即对该塘口的不同生态位进行细菌分离、鉴定及人工感染试验，同时分析菌株的毒力基因及耐药性，以期为团头鲂出血病的发病机理及分子流行病学研究提供基础数据，为该病的防控提供一定的理论基础。

1材料与方法

1．1发病塘口及菌株

2010年7月11日常州武进某团头鲂池塘出现大批团头鲂死亡的情况。塘口检查发现病鱼游动缓慢，摄食减少，肠道内食糜少或无，体表腹部、尾鳍以及鳃部有出血点，部分有大面积的皮肤溃烂。解剖检查发现一部分病鱼肝脏发白、肿大，一部分有溶血性腹水。采集该池塘病鱼21尾，利用选择性培养基分离细菌，分离位点包括鱼的肠道、体表黏液、鳃、腹腔、肝脏、肾脏等。同时采集该池塘的水样、底泥，利用选择性培养基分离水体、浮游生物和底泥中的细菌。

1．2主要试剂及培养基

细菌生化鉴定管、药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司，细菌基因组DNA提取试剂盒、PCR扩增试剂盒购自大连宝生物工程有限公司，RS培养基［8］、LB培养基为本课题组配制。

1．3细菌的分离、筛选

病鱼肠道、体表黏液、鳃、腹腔、肝脏、肾脏等位点用接种环划线RS固体培养基;将池塘水经25μm的膜或者滤纸过滤后，水体位点的菌株用过滤后的水涂RS培养基;浮游生物位点则是将滤纸浸入无菌生理盐水、振荡后，划线RS固体培养基;底泥经无菌生理盐水稀释后涂RS培养基。RS培养接种后，28℃培养24h。随机挑选5个单菌落划线接种LB固体平板。用氧化酶、接触酶、O/F、鸟氨酸脱羧酶对单菌落作进一步筛选，鸟氨酸脱羧酶阳性为维氏气单胞菌区别与其他气单胞菌的主要生化特性［9］。对4个生化指标都为阳性的菌株接种LB液体，28℃培养24h后，用15%液体甘油－80℃保存备用。

1．4维氏气单胞菌鉴定

1．4．1细菌DNA模板的制备

将保存在－80℃中的菌株，接种LB液体培养基，28℃培养18h，离心收集菌体，参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取细菌总DNA，作为DNA模板。

1．4．2维氏气单胞菌管家基因测序与系统发育树的构建

根据气单胞菌16SrDNA和管家基因gyrB，通过构建系统发育树鉴定细菌菌株。16SrDNA引物为AER－F(5'－CTACTTTTGCCGGCGAGCGG－3');AER－R(5'－TGATTCCCGAAGGCACTCCC－3')［10］由上海生工合成。反应条件:94℃变性2min;接着30个循环:94℃30s，58℃30s，72℃60s;最后72℃延伸10min。取2μLPCR产物，用1．2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统拍照，片段大小953bp。有目的片段则判断该菌株为气单胞菌属。管家基因gyrB扩增引物:gyrB－3F(5'－TCCGGCGGTCTGCACGGCGT－3')和gyrB－14R(5'－TTGTCCGGGTTGTACTCGTC－3')［11］由上海生工合成。反应条件:94℃变性2min;接着30个循环:94℃30s，59℃30s，72℃90s;最后72℃延伸10min。取2μLPCR产物，用1．2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统下拍照，片段大小为1100bp。PCR产物纯化后送上海生工序列测序。系统发育树的构建:将测序菌株的gyrB序列用Blast软件与GenBank数据库中相关的亲近物种进行相似性分析，并用Mega4．1中的Neighbor－Joining法构建系统进化树。

1．4．3维氏气单胞菌的生化特性

将菌株接种生化培养管后，28℃培养24h，观察并记录结果。生化特性包括赖氨酸脱羧酶、苯丙氨酸转氨酶、硝酸盐(还原)、硫化氢、明胶、葡萄糖、乳糖、β－半乳糖苷(ONPG)、山梨醇、赤鲜醇、卫矛醇、丙二酸盐等。

1．5维氏气单胞菌的人工感染

对确定为维氏气单胞菌的菌株进行人工感染试验，验证其致病性。具体方法为:将菌株单菌落接种LB液体培养基，28℃培养20h，将细菌浓度稀释为109CUF/mL。每个菌株腹部肌肉注射5尾鱼，鱼体重(100±3)g，注射剂量为每100g鱼体重0．5mL菌株。然后观察鱼的发病、死亡情况，统计24h、48h的死亡率，并对人工感染后具有典型症状的死鱼进行拍照、解剖以及优势菌的分离鉴定。

1．6维氏气单胞菌毒力基因的检测

用PCR检测气单胞菌的2种主要毒力基因。溶血素基因hly，片段大小597bp。引物为hly－F(5'－GGCCGGTGGCCCGAAGATACGGG－3')和hly－R(5'GGCGGCGCCGGACGAGACGGG－3')［12］。反应条件:94℃变性3min，接着30个循环:92℃30s，65℃30s，72℃60s;最后72℃延伸10min。细胞兴奋性肠毒素基因alt，片段大小442bp。引物为alt－F(5'－TGACCCAGTCCTGGCACGGC－3')和alt－R(5'－GGTGATCGATCACCACCAGC－3')［13］。反应条件:94℃变性3min;接着30个循环:92℃30s，60℃30s，72℃60s;最后72℃延伸10min。