2021-4-10 | 农业
原位生态修复技术是利用沉水植物在养殖塘中的控藻增氧效应，对养殖塘中氮、磷等营养物质的吸收同化作用，并应用鱼、草、蟹、虾、贝等构建水域生态系统，完善食物链网，同时提供天然饲料和水生动物栖息地，改善养殖塘环境；结合异位生态处理塘、养殖工艺特点进一步削减养殖污水排放，同时从水产养殖健康生态系统角度分析，发挥水域生态系统功能，形成生态化健康养殖模式［１－２］。而浮游细菌是水生态系统的分解者和小型滤食性动物的饵料，在湖泊生态系统的物质循环和能量流动中具有重要的作用，水质的优劣、水体生态状况的改变都会对细菌群落的组成产生影响［３］。此外，水产养殖系统内细菌在物质循环、病害发生与否及水产养殖对象的生长、营养和免疫方面都产生重要作用，与水产养殖系统有关的微生物群落结构研究也有报道，但对于系统微生物状况的持续变化以及养殖菌剂对微生物系统影响的报道不多［４－７］。随着分子生物学方法的发展，以基因检测为基础的微生物检测方法在群落结构的动态监测中具有快速、便捷的优点，变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）是目前应用较为广泛的微生物群落结构分子生物学检验方法之一。笔者除了采用传统法研究微生物数量变化之外，还采用ＤＧＧＥ技术对在养殖区内微生物群落结构的变化开展了较深入的研究，旨在为陆域养殖系统的生物修复提供理论基础。
１材料与方法
１．１材料
实验基地位于江苏无锡市郊胡埭镇龙延村直湖港岸边。由于水产养殖主要收获季节在６—１０月，于２００９年和２０１０年的６月、８月、１０月３个月在无锡直湖港陆域水产养殖区内采集水样，养殖区包括进水口、蟹塘１号、蟹塘２号、蟹苗塘、鱼塘１号、鱼塘２号、鱼苗塘及甲鱼塘８个点（图１）。
１．２方法
１．２．１环境细菌的检测和样品总ＤＮＡ的提取
采用平板培养法测定异养细菌数量，用０．２ｍ的聚碳酸酯膜过滤２００ｍＬ水样富集水中的细菌，采用申能博采的“环境样品ＤＮＡ提取试剂盒”进行水样细菌总ＤＮＡ的提取，具体操作方法参见说明书。
１．２．２ＰＣＲ－ＤＧＧＥ扩增
根据参考文献［１０］，采用上海英骏公司合成的引物序列Ｐ３３８ｆＧＣ：５’－ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣＧＧＧＧＧＧＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ－３’和５１８ｒ：５’－ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ－３’，用于扩增细菌１６ＳｒＤＮＡ的Ｖ３区段，片段长度为２３６ｂｐ。扩增总体系为５０μＬ：模板ＤＮＡ４０～８０ｎｇ；１０ｍｍｏｌ／Ｌ４×ｄＮＴＰｓ１．５μＬ，５Ｕ／μＬＴａｑ酶１μＬ，２０ｐｍｏｌ／μＬ引物各１．５μＬ，１０×扩增缓冲液（含Ｍｇ２＋）５μＬ，ｄｄＨ２Ｏ补足至５０μＬ。ＰＣＲ扩增条件：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃１ｍｉｎ，５５℃退火３０ｓ，７２℃３ｍｉｎ，３５个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ。反应产物直接用于变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）分析。
１．２．３ＰＣＲ－ＤＧＧＥ凝胶电泳及结果处理
ＤＧＧＥ凝胶电泳∶所用胶浓度为８％（丙烯酰胺∶双丙烯酰胺＝３７．５∶１，体积比），细菌ｐａｇｅ胶变性梯度５５％～７０％，真核生物变性梯度３０％～５０％，用１×ＴＡＥ作为电泳缓冲液。每孔上样量５０μＬ。在６０℃，１５０Ｖ电泳３００ｍｉｎ后溴化乙锭染色，紫外凝胶成像观察。通过ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ软件将ＤＧＧＥ图谱照片转化成数字信号，运用ＭＳＶＰ软件对ＤＧＧＥ指纹图谱的多样性和相似性数据进行计算，用ＳＰＳＳ软件进行主成份分析（ＰＣＡ分析）。多样性和相似性的计算方法分别采用香侬威纳（Ｓｈａｎｎｏｎ－Ｗｉｅ－ｎｅｒ）多样性指数和索伦森相似性系数（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ’ｓＣｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）表示。
２结果与分析
２．１细菌数量变化
从异样细菌变化情况（图２）可知，养殖区内的异样细菌数量变化波动较大，特别是２个鱼塘的细菌数量波动可达１０倍以上。从图３也可看出，采用综合治理技术的蟹塘１号及蟹塘２号的微生物数量明显下降，分别从２００９年的６５００个／ｍＬ及１１０００个／ｍＬ下降到２０１０年的１５００个／ｍＬ和２０００个／ｍＬ，水质净化效果明显，证明综合治理技术确有效果。在其他养殖塘内，鱼塘的细菌数量一直较高，最高１７０００个／ｍＬ，两年的平均值也都在１００００个／ｍＬ上下波动，这可能与养殖密度较高有关，相对鱼苗塘和甲鱼塘细菌数量变化较小，平均值都在５０００个／ｍＬ左右。统计数据亦表明，２０１０年的微生物数量总体低于２００９年同期，这可能与养殖方式的改进以及太湖整体水质变好有关。
２．２水样细菌的１６ＳｒＤＮＡ多态性
采用ＤＧＧＥ分析ＰＣＲ产物，均得到若干分离的条带（图４）。每个月的电泳图谱条带一直在变化，而且每个图谱中共有条带并不多见，因此，在不同的养殖系统内，微生物的变化非常明显，很难找到共有的微生物的存在。尽管８个养殖池水是相通的，但每个池内的小生态系统对微生物的影响较大，导致这一变化的出现。
２．３细菌的Ｓｈａｎｎｏｎ－Ｗｉｅｎｅｒ多样性指数
由图５可见，８个样点的香农威纳指数都在２．０以上，多样性较好，进水、蟹塘以及鱼塘２号的多样性指数变化稍大，可能与生态系统不太稳定有关，而鱼苗塘、甲鱼塘的多样性指数较为稳定，联系微生物数量来看，这２个塘的生态系统较为稳定，可能与两塘受到的外界干扰较少有关。从图６可见，２０１０年的微生物多样性普遍高于２００９年，这也表明，２０１０年微生态系统情况好于２００９年，也从另一个方面说明水质有变好的趋势。