土壤线虫的多样性

土壤线虫是植物根际土壤生物区重要的后生动物，在自然界中数量庞大，种类繁多，且直接参与土壤生态系统的物质循环和能量流动，对有机物的分解、养分转化和能量传递起到关键的作用，是土壤生态系统的重要组成部分。土壤线虫生存能力、繁殖能力和环境适应能力强，且对环境变化敏感，其群落组成能够反映出土壤的理化和生物性状，因此土壤线虫成为评价土壤健康的重要指示生物。目前，人们对自然和半自然生态系统及不同环境条件和管理措施下农田生态系统的土壤线虫群落进行了大量研究[1-3]，揭示了不同土壤条件下土壤线虫的群落特征，并反映出土壤的质量状况。目前，土壤线虫研究多采用线虫形态鉴定法，这使得土壤线虫群落研究只能在线虫科、属和功能群水平上进行[4]，而且形态鉴定法工作量大、费时费力、难以快速分析多个土壤样品的线虫群落特征，这使得土壤线虫研究在物种深度和样品广度方面存在缺陷[5]，限制了土壤线虫研究的发展。随着分子生物学的快速发展，分子生态技术被应用到土壤线虫研究中，为线虫分类鉴定和系统关系的分析提供了一个有效的工具。通过线虫基因序列的比对分析，不仅可对线虫进行准确的分子鉴定和系统发育的研究，而且为线虫姊妹种的鉴定和幼虫的分类提供了可靠的依据，极大地提高了土壤线虫研究的精度和效率。本文对分子生态技术在土壤线虫研究中的应用现状进行综述，以期为土壤线虫的分子生物学研究提供参考。

1分子生态技术在土壤线虫研究中的优势

分子生态学是生态学和分子生物学相互渗透、结合而发展起来的新学科，它依靠分子生物学的理论和技术来分析、解决生态学问题。分子生态技术是分子生态学的研究方法，能够在核酸和蛋白质水平上阐明生命系统与环境系统的相互作用规律，克服了传统生态学技术的局限，具有巨大的优势。在土壤线虫研究中，分子生态的优势主要体现在如下4个方面：

1.1适用于高通量分析

线虫的多个基因可用于分子鉴定，如18SrDNA、ITS和线粒体DNA等。高通量测序技术的应用极大地提高了分子鉴定的效率，这使得宏基因组技术能够用于土壤线虫研究，提高了土壤线虫指示土壤环境质量状况的精度。

1.2能够进行遗传分析

利用同源基因分析物种的同源性比利用形态分析更简单、可靠。多种线虫的基因序列能够用于遗传分析，并构建进化树，确定线虫的进化地位。

1.3便于交流分析

线虫分子分类DNA序列登陆到数据库后，全世界的线虫研究专家可共享、下载数据，进行分析，这将促进土壤线虫研究交流和发展。

1.4在种水平上鉴定线虫种类

DNA序列是内在的遗传特性，是线虫种类的本质特征，因此分子鉴定能够在本质上区分线虫种类，克服了线虫形态鉴定的缺陷。线虫形态鉴定只能在种属水平上进行，且需要在显微镜下观察线虫形态特征，效率低下。而分子鉴定能在种水平鉴定线虫种类，能够快速鉴定土壤样品中的线虫种类，提高了线虫鉴定的精度和丰度。

2分子生态技术在土壤线虫研究中的应用

2.1分子标记技术

分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映，广泛应用于物种分类、遗传图谱构建和目标基因定位等。Vanderknapp等[6]利用随机引物PCR区分了2种亲缘关系较近的食细菌线虫，表明分子标记技术可应用于线虫生态学研究。Yeates等[5]认为分子技术需要反映出某些特定线虫种或功能群的相对数量，而且至少需要3对引物对单条线虫进行标记。随后，多种分子标记技术应用到线虫研究中，如限制性片段长度多态性（RFLP）[7]、随机扩增多态性（RAPD）[8]和扩增片段长度多态性（AFLP）[9]。然而这些方法均具有明显的缺点，如RFLP的PCR扩增片段长度和酶切片段长度太短，仅仅提供有限的信息，因此只能对少量的已知物种进行区分；RAPD和AFLP提供的信息数量较大，片段长度为100bp左右，但仅靠片段差异多态性不能够区鉴定出物种种类。

2.2DGGE技术DGGE技术

能够区分长度相同、但序列差异的DNA片段。该技术首先应用于微生物群落研究，分析样品中微生物的物种信息和时空变化，并可通过对条带的序列分析或与特异性探针杂交分析鉴定群落组成。Waite等[10]将该技术应用到线虫群落研究中，揭示出欧洲草坪土壤线虫种群的多样性，但未将DGGE分析结果与线虫形态鉴定结果相比较，也未揭示线虫遗传多样性和物种丰度信息。Foucher等[11]采用PCR方法扩增线虫18SrDNA区域630bp的片段，并利用DGGE分析扩增片段的多样性，以此鉴定线虫种类，该方法快速高效。虽然DGGE技术具有较多的优点，但仅依靠电泳条带不能揭示每个物种的丰度和遗传进化信息，因此不能完全揭示土壤线虫群落特征。

2.3线虫18SrDNA测序技术

18SrDNA是编码真核生物核糖体小亚基rRNA的DNA序列，序列中既有保守区又有可变区，保守区反映了物种间的亲缘关系，可变区反映出物种间的差异，在系统发育研究中适用于种级以上的阶元分类。内转录间隔区ITS位于核糖体rDNA18S、5.8S和28S之间，属于中度保守区域。18SrDNA和ITS序列测序技术为分子分类中常用的方法。Floyd等[12]依据线虫18SrDNA基因序列划分“分子操作分类单元（MOTU）”，将序列相似度大于99.5%归为同种线虫。Eyualem等[13]利用18SrDNA测序方法将形态鉴定的5种Panagrolaimus线虫重新划分为2个种。Griffiths等[14]采用18SrDNA基因克隆文库的方法分析了2个位点的土壤线虫群落结构，通过BLAST比对和构建进化树来划分线虫类群，揭示出不同类群线虫的比例，研究发现土壤线虫以Hoplolaimidae、Telotylenchidae、Cephalobidae和Prat-ylenchus为主，然而分子方法揭示的Rhabditida和Tylenc-hida比例低于形态学鉴定的结果。除了18SrDNA之外，应用于线虫分子分类的基因还有ITS[15]和线粒体DNA等[16]。但是，该技术构建克隆文库的效率低，难以满足高通量分析。