卡培他滨的生态毒性

前言

20世纪70年代，Garrison等首次在生活废水中检测到了药物成分，引起社会上的广泛关注。随后，在污水处理厂、河流、湖泊、海洋、甚至饮用水中都检测到了不同的药物化合物［1］，如抗生素、降压药、降脂药、止痛剂、抗抑郁药、β受体阻滞药、抗癌药等。在欧洲，进入到环境中的药物活性成分已有4000余种［2］。这些药物活性成分对水环境生态安全和人体健康已构成威胁［3］。

四膜虫是一种单细胞原生动物，是毒理学与生态毒理学研究中的优良模式生物之一，并已广泛应用于药物、无机物、有机物的毒理学评价［4－6］。Bamadad等［7］在研究多环芳烃(PAHs)对四膜虫的毒性损伤时，发现四膜虫有类似于普遍存在于哺乳动物肿瘤细胞上、与肿瘤细胞耐药性有关的MDR泵，免疫细胞化学研究结果也进一步证实了这一点。

卡培他滨(CAP)，即5'－脱氧－5－氟－N－［(戊氧基)羰基］胞啶，是一种对肿瘤细胞有选择性活性的口服细胞毒性制剂，在体内可被代谢为5－氟尿嘧啶(5－FU)，从而发挥抗肿瘤作用。卡培他滨的代谢物中，除了5－FU，其它物质在体外试验中均不具有细胞毒性。CAP、5－FU及其它代谢物主要通过肾脏排出，其中2.9%是以CAP原形排出(图1)。根据IMSHealth2007的统计，2006年，CAP在欧洲的使用量为28827kg。由于使用量大，加之易溶于水(LogKow为4．5，Roche2008)，因此CAP及其代谢物对水生生态的影响不容忽视。目前对于环境中CAP残留的生态毒性数据极为缺乏，最近有报道指出，CAP对羊角月牙藻有很强的毒性，72h－ErC50为2.0mg/L［8］。而研究CAP对其他模式生物如四膜虫等影响的报道较为罕见。

本文以四膜虫为模式生物，研究了CAP对嗜热四膜虫细胞的生长以及多药耐药性(MDR)的影响，尝试探索CAP的生态毒性问题，为其科学管理提供依据。

1材料和方法

1．1试验用四膜虫和培养液

嗜热四膜虫(TetrahymenaThermophila，SB210)由中国科学院武汉水生生物研究所馈赠。培养液:胰蛋白胨10g，酵母提取物1g，葡萄糖2g，溶于1L蒸馏水中。搅拌使其充分溶解后分装于10mL试管和250mL锥形瓶中，用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20min，冷却后于4℃保存。

1．2试剂与仪器

胰蛋白胨和酵母提取物均为Oxide公司产品，葡萄糖(AR，购自国药集团化学试剂有限公司)，罗丹明(RhodamineB，Sigma－Aldrich，购自于DAHU)。自动手提式灭菌锅(YXQ－LS－18S，上海博讯)，光照培养箱(SPX－250B－G，上海博讯)，多功能酶标仪(ThermoVarioskanFlash)，DSH－系列超净工作台程控仪(上海淀山湖净化设备厂)，高速离心机(3K30，Sigma)。

1．3四膜虫的培养

接种于装有5mL无菌培养液的试管中，置于恒温培养箱中30℃培养48h，随后移取试管中的培养液至250mL锥形瓶中，进行扩大培养，达到对数生长期时即可进行后续实验。

1．4四膜虫浓度与OD值的关系

移取对数生长期的四膜虫细胞液200μL至1.5mL离心管中，加入200μL1%的甲醛进行固定。在显微镜下用原生动物计数框计数，每个样品平行计数5次，最后取平均值，并计算出四膜虫细胞浓度。移取已知浓度的四膜虫细胞悬液，稀释不同倍数。用96孔板读数，并绘制四膜虫浓度与OD值关系曲线。

1．5CAP对四膜虫的毒性试验

在装有45mL无菌培养液的锥形瓶中，加入50μL不同浓度的CAP溶液，并接种5mL预培养至对数生长期的嗜热四膜虫培养液，使CAP终浓度为0.25、1、4、16μM，每个浓度设置3个平行，另设无CAP的对照。30℃培养。在不同培养时间取培养液于96孔板读数，测定OD值，并根据四膜虫浓度与OD值关系曲线，计算出相应的四膜虫浓度。

1．6CAP对四膜虫多药耐药性的影响试验

移取10mL对数生长期的四膜虫培养液于已灭菌的离心管中，分别加入10μL不同浓度的CAP溶液和10μL罗丹明B溶液(浓度为3mM)，使CAP终浓度为2和16μM，以CAP浓度0μM为对照，每个浓度设置3个平行。在恒温培养箱中30℃黑暗培养不同时间，离心收集细胞(1000g，6min)，并用pH为7.4的冰PBS洗涤3次，弃上清液，冻融3次以破碎细胞，随后加入1mLPBS，室温下12000rpm离心6min，取上清液加入96孔板，每孔加100μL。用多功能酶标仪测定荧光强度，激发波长540nm，发射波长590nm。

2实验结果与讨论

2．1四膜虫浓度与OD值关系曲线

四膜虫浓度与OD值关系曲线见图2，方程为y=0．0292x+0．051，R2=0．9891。2．2CAP对四膜虫的生长抑制作用四膜虫在培养24h后进入对数生长期，细胞浓度明显增加，48h后进入稳定期。在36h内，不同测试浓度的CAP(0.25、1、4、16μM)对四膜虫的生长几乎无影响(见图3);在48h，CAP浓度为16μM组与对照组相比四膜虫浓度较低;但在随后时间内，CAP浓度为16μM组的四膜虫细胞浓度快速增加。总体而言，在实验药物浓度范围及暴露时间内，未观察到CAP对四膜虫的生长有明显抑制。说明CAP对四膜虫细胞的毒性作用不大，这有可能是因为进入四膜虫体内的CAP被四膜虫的MDR泵排出体外。

2．3CAP对四膜虫多药耐药性的影响

在一定体积的四膜虫悬液中加入罗丹明B，黑暗中培养不同时间，测定四膜虫体内罗丹明B的积累(见图4)。随着培养时间的增加，四膜虫体内罗丹明B的荧光强度明显增强。相同培养时间内，药物浓度为2μM组的荧光强度略高于对照组和药物浓度为16μM组。说明CAP对四膜虫体内染料的排出机制有一定影响，但不显著。CAP作为抗癌常用药物，只有在体内被代谢为5－FU时才发挥相应作用，而CAP本身并不能抑制肿瘤细胞的MDR。通过CAP对罗丹明B在四膜虫体内积累的试验可以证实，CAP对四膜虫的MDR的影响亦不显著。