2021-4-10 | 农业
钉螺是日本血吸虫的唯一中间宿主，我国现有钉螺面积95%以上分布在长江流域的湖沼地区［12］。这些地区因长江水位不稳定，环境复杂，常规药物灭螺难以达到理想效果。始于20世纪80年代的林业血防工程，通过环境改造形成以林业为主的林、农、副、渔等有机结合的自然经济社会复合生态系统，以改变钉螺适宜生存的温度、土壤湿度、光照、植被等环境因子，从而抑制钉螺孳生，达到抑螺防病的目的［34］。安徽省自实施兴林灭螺项目以来，在滩地通过适当的工程技术措施，栽植耐水湿树种并间种农作物，有效地改变钉螺的孳生环境，钉螺密度大为降低，同时钉螺的生理生化也可能发生变化［56］。为探讨钉螺在生态改变后环境胁迫下的分子水平变化，本实验通过采集长江安徽段上中下游3地林业血防工程示范点和草滩对照点的钉螺，对钉螺细胞色素氧化酶Ⅰ（COⅠ）基因扩增和测序，建立系统发生树，从分子生物学角度进行探讨，从而为从分子水平上研究兴林抑螺的机制提供依据。
1材料与方法
1.1钉螺样本
分别在长江安徽段上游安庆新洲（AQL）、中游铜陵胥坝（TLL）、下游无为刘渡（WWL）的林业血防工程区，同时在上述3个林业血防工程区邻近区域各选择1块草滩环境作为对照区，即安庆草滩（AQC）、铜陵草滩（TLC）、无为草滩（WWC），于2011年春季现场采集一定数量钉螺，室内短期饲养后以逸蚴法剔除血吸虫感染性钉螺后的样本作为实验材料，洗去淤泥后放无水乙醇中4℃保存。
1.2试剂
大肠埃希菌（E.coli）DH5α为本实验室保存，pMD18Tvector购自大连TaKaRa公司。DNA提取试剂盒（K703，DNAzsolE，购自上海博彩公司），pfuDNA聚合酶，dNTPs、DNA标志物和琼脂糖均购自大连TaKaRa公司。
1.3基因组
DNA提取采用基因组DNA提取试剂盒，从钉螺头足部肌肉组织中提取DNA，DNA用TE溶解后，测定DNA纯度和浓度，-20℃保存备用。
1.4PCR扩增
COⅠ基因及产物鉴定引物设计根据参考文献［3］，序列如下：上游引物：5′GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG3′；下游引物：5′TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAAYCA3′。PCR反应总体积25μl，包括ddH2O15.5μl，10×Buffer2.5μl，dNTP2μl，模板DNA3.5μl，10μmol/L上、下游引物各0.5μl，pfuDNA聚合酶0.5μl。循环条件为：95℃预变性10min，94℃变性1min，51℃退火90s，72℃延伸105s，共进行35个循环，末次循环72℃延伸10min。PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶中电泳，，凝胶成像系统观察照相。
1.5PCR产物
TA克隆与测序采用胶回收试剂盒回收纯化PCR产物，在T4DNA连接酶的作用下，纯化产物与pMD18Tvector，16℃连接45min。重组质粒转化入感受态细菌E.coliDH5α，然后均匀涂布于含Xgal和IPTG的AMP+平板中进行蓝白斑筛选，PCR鉴定后，挑选阳性克隆菌液送上海英骏生物技术公司测序。1.6COⅠ基因序列分析从GenBank中检索出微小钉螺（DQ212795，WX）、双脐螺（AF199111，SQ）作为外群参照序列［78］。将测序结果用ClustalX（1.81）软件进行多序列比对，MEGA3.1软件Kimura2parameter法计算遗传距离，非加权组平均法（UPGMA）和邻近法（NJ）构建系统发生树，Bootstrap进行检验。
2结果
2.1试点概况
3个林业血防工程区基本情况见表1。
2.2COI基因扩增
以安庆、铜陵、无为工程区和草滩区6个不同环境钉螺基因组DNA为模板，PCR特异性扩增mtDNACOⅠ基因，扩增产物经1%琼脂糖电泳，利用合成的引物扩增出约700bp（含两端引物）的片段，与预期目的片段大小一致成虫开始产卵有关。Yoshio等［10］发现在曼氏血吸虫感染后的产卵期，不管是Th17型还是Th1型免疫反应均会受到抑制。但迄今为止，虫卵诱导Th17型和Th1型免疫反应下调的具体机制还不是很清楚。Romagnani［11］报道了IL4在促进Th2细胞分化的同时抑制了Th17细胞的分化，而Th1型免疫反应的抑制也与IL4（Th2型）和IL10（Treg）的高表达有关。因此我们推测，进入产卵期后，IL17介导的Th17反应和Th1型反应有可能逐渐向Th2反应偏移。
在转录水平的研究中发现，感染日本血吸虫后小鼠体内IL17A及IL23p19的mRNA和蛋白表达水平变化基本上是一致的。但值得注意的是，在感染4周后，IL17A及IL23p19mRNA的表达出现了升高的趋势，这与同期蛋白表达水平变化不一致，其原因一方面可能是mRNA与蛋白水平的表达本身是不尽相同的，另一方面可能是由于蛋白表达具有时效性，同一时间的mRNA表达水平不能代表蛋白水平。通过相关性分析我们还发现，在感染小鼠的脾脏组织中，IL17A和IL23p19的mRNA表达呈正相关，进一步证实了IL23对血吸虫感染后小鼠脾脏组织中Th17细胞的增殖和存活具有重要意义，可促使其分泌IL17，从而介导一系列的免疫反应。
本研究证实了炎症细胞因子IL17和IL23在日本血吸虫自然感染早期的表达水平升高，说明Th17细胞分泌的IL17作为一种重要的炎性因子，参与了血吸虫病的发生发展过程，并且IL23在这一过程中也发挥了重要的作用。本次研究我们只对IL17A及IL23p19两种细胞因子进行了检测，下一步我们将在细胞水平上对Th17细胞以及Th细胞其它亚群进行研究，以进一步揭示血吸虫感染免疫机制以及宿主与寄生虫的相互关系。