2021-4-10 | 药学毕业论文
一、安全性评价
剑尾鱼（Xiphophorushelleri）是一种用于环境化合物安全性评价的优良实验鱼类。以剑尾鱼作为实验鱼类，用不同的生物标志物，如EROD、ERND、GST等酶活性和CYP1A、CYP3A、GST和P-糖蛋白mRNA的表达水平，对三氯生（TCS）的毒性进行评估。急性毒性试验表明，CYP1A、CYP3A、GST和P-糖蛋白的mRNA的表达水平均呈剂量效应关系，表明TCS对水生生态系统存在潜在生态风险。类似的实验也发现，暴露于全氟辛烷磺酸（PFOS）中的剑尾鱼的生长状况、性腺指数（GSI）、肝指数（HSI）均出现明显变化。因此，以HSI和GSI来评估长期暴露条件下化合物毒性，是优良的亚致死化学评估方法。经甲基睾酮的诱导，雌性剑尾鱼随诱导时间的延续均出现了雄性第二性征，体形、鳍、骨骼均发生了不同程度的变化，性腺呈现萎缩退化趋势，生殖能力受到影响。其中臀鳍、尾鳍和骨骼的变化最明显，可作为水环境风险评价的有效生物学标记并应用于环境雄激素生物监测。稀有?鲫（Gobiocyprisrarus）是我国特有的对环境化合物敏感的小型实验鱼类，已广泛应用于水生态毒理学研究。根据最近的研究资料，稀有?鲫被暴露于17α-炔雌醇、双酚A、己烯雌酚和壬基酚等激素类化合物中，性别分化和性别相关基因的表达被受到影响，其生长发育，免疫反应、物质代谢等受到多氟和全氟化合物联合作用、氯苯胺等化合物作用的影响。可将稀有?鲫作为检测化合物毒性和评价水环境中化合物污染的实验用鱼。姜锦林等（2012，2013）观察了微囊藻毒素（MC-LR）与阿特拉津单一染毒和复合染毒对鲤鱼的生态毒理效应，研究其肝毒性及毒素积累，其肝脏通过ROS途径和PP抑制途径诱导解毒。该研究阐明了水环境中低浓度污染物共存对鱼类的潜在风险，可为环境污染物安全阈值的确定和污染物水生态风险评价的完善提供科学依据。
二、药物筛选与新药发现
1、抗肿瘤药物的筛选
LiY等（2012）用斑马鱼对502种天然化合物进行抗肿瘤药物筛选，采用MTT法与MCF7乳腺癌细胞株比较，结果在斑马鱼中检测到59种有毒化合物，其中28例化合物诱导细胞凋亡和激活p53通路。其对抗肿瘤及诱导细胞凋亡的药物生产具有指示作用。张红翠等（2012）采用MTT法检测顺铂、紫杉醇、阿霉素、5-氟尿嘧啶等4种药物对HL-60和Hela细胞增殖的影响，并观察药物对斑马鱼胚胎发育的影响。发现这4种抗肿瘤药物对斑马鱼胚胎的生长发育均有致畸作用。斑马鱼胚胎作为细胞毒性类药物筛选模型，对于抗微管类药物较为敏感，但对于抗代谢药物敏感性较肿瘤细胞差。WangC等（2010）也利用转基因斑马鱼卵筛选出了具有抗肿瘤和抗血管生成活性的化合物罗苏伐他汀。
2、心血管药物的筛选
HeZH等（2009）以转基因斑马鱼对大黄的4个组分和5个蒽醌类化合物进行筛选，发现大黄素、芦荟大黄素和大黄酸具有较强的抗血管生成作用，并证明大黄抗炎可能与抗血管生成有关。NiTT等（2012）用心肌被GFP标记的Tg（cmlc2：EGFP）转基因斑马鱼做药物筛选，发现小分子Cardionogen能增加心肌细胞的数量，促进小鼠ES细胞向心肌细胞分化。胚胎和细胞实验结果显示Cardionogen跟经典Wnt信号通路相互拮抗。
3、神经系统药物的筛选
KokelD等（2010）的斑马鱼实验证明STR-1为新的乙酰胆碱酯酶抑制剂，而STR-2在活体动物实验中也能抑制乙酰胆碱酯酶活性。说明利用活体动物行为实验可以发现新的刺激神经的化合物及研究其机制。由于斑马鱼在生理和行为学方面的特点，可作为应激及焦虑新模式生物，更适合中药抗焦虑药药理研究和药物筛选。
4、肥胖症和动脉硬化药物的筛选
JonesKS等（2008）以斑马鱼检测已知药物（PPAR激动剂、乙型肾上腺素激动剂、SIRT-1激动剂、烟酸）的促脂肪代谢作用。结果显示，这些药物都能促进斑马鱼的脂肪代谢，提出斑马鱼胚胎卵黄囊内的脂肪含量可以用作筛选调节脂肪代谢药物的指标，而哺乳动物肥胖症模型很难用于高通量筛选。应用转基因技术构建Agouti相关蛋白过量表达模型可模拟瘦素缺陷的人类肥胖疾病，并可应用于减肥药的大规模筛选。加利福尼亚大学医学院的Miller等（2009）利用动脉粥样硬化模型观察血管内壁的增厚情况，并利用此模型成功筛选出ezetimibe，该药有减轻血管壁增厚和增强血管壁屏障的作用。此模型对研究血管壁的变化和脂类堆积有很大帮助，同时利用此模型也可进行药物筛选和新药发现。
三、药物药理学研究
颜慧等（2010，2012）的实验研究表明，通过成瘾性药物吗啡和甲基苯丙胺作用于斑马鱼自发活动及T迷宫两个行为模型，对成瘾性药物运动活动性、位置偏爱、认知功能等方面的影响进行快速评价，与大小鼠模型相比，斑马鱼对神经系统类药物反应的灵敏度较高，水平与垂直方向的行为指标可提供更多的信息，能较全面地反映药物对动物行为的影响。BownikA等（2012）将鲤鱼暴露在高浓度的类毒素-A中，ATP水平降低，低浓度和高浓度均影响细胞凋亡和坏死，T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖能力降低，是水生环境中可能的免疫毒性剂，会增加鱼的感染和患肿瘤疾病的可能性。金鱼（Carassiusauratus）是我国驯化的观赏鱼类，也常用于药理学实验研究。例如将金鱼口服印楝素，研究印楝素对金鱼非特异性免疫反应和抵抗病原菌嗜水气单胞菌的作用，检测其免疫参数和血清生化指标，可作为水产养殖的潜在的免疫增强剂和研究其免疫作用机理。
四、药物代谢研究
斑马鱼可用于药物代谢研究。AldertonW等（2010）在斑马鱼幼体中分析了一系列常用的人CYP酶探针底物的积聚和代谢情况，发现他克林（CYP1A2）、双氯芬酸（CYP2C9）、安非他酮（CYP2B6）、睾酮（CYP3A4）等药物能在受精7d后的斑马鱼幼体中发生羟化反应。对化合物西沙必利、氯丙嗪、维拉帕米、睾酮和右美沙芬代谢物的分析发现，在斑马鱼幼体中能催化发生一相代谢反应（氧化、N-脱甲基、O-脱乙基和N-脱烷基）和二相代谢反应（硫酸化和葡糖醛酸化）。非那西丁（CYP1A2）和右美沙芬（CYP2D6）分别能被代谢为扑热息痛和右啡烷，这与人体中的代谢产物一致。LiZH等（2011）利用转录组学以及蛋白质组学的方法检测到，斑马鱼与哺乳动物的代谢酶体系具有极度相似性，由此构建了斑马鱼研究中药及其单体药物代谢的平台。对淫羊藿黄酮类化合物及其衍生物在斑马鱼整体模型中的代谢途径、分布机制进行探讨，为斑马鱼成为一种实用的体内代谢筛选模型提供了理论依据。虹鳟被单独灌喂三聚氰胺、氰尿酸与同时灌喂此两种化合物，发现，当剂量单独，虹鳟对三聚氰胺和氰尿酸的肾残留耗尽比在两种化合物一起更快。可以此对动物组织中三聚氰胺残留进行相关风险评估并研究其剂量效应。以灌喂方式喂以土霉素（OTC）研究其药物代谢及消残规律，发现其使用多剂量比标准单剂量效果要好。实验鱼类对药物代谢研究所作出的贡献，为现有哺乳动物的药物代谢数据提供了新的信息。
五、中药研究
以斑马鱼开展中药研究已有许多例子，例如研究黄芪的药理作用。研究表明，黄芪中的黄芪甲苷与多糖成分能显著促进斑马鱼体内HUVEC的增殖、迁移以及管形形成等，能上调VEGF、Kdr1、Flt1mRNA的表达，同时能激活Akt信号通路。但不能引起血管新生，对受损的血管新生功能具有较强的修复作用。当归挥发油中分离的正丁烯夫内酯能显著抑制斑马鱼肠下静脉的生成，体外能抑制HUVEC细胞周期的进程，引起细胞的凋亡并激活P38和ERK1/2的信号通路。槲皮素和芦丁药物可在不影响斑马鱼体正常运动的情况下预防由东莨菪碱导致的记忆障碍，且槲皮素和芦丁等植物成分可能成为神经系统疾病（如阿尔茨海默症）的治疗药物。斑马鱼连续暴露于续断总皂苷溶液中，可以显著提高斑马鱼的认知和记忆能力及Na+-K+-ATP酶的活力。绿茶中微量成分表儿茶精可明显减弱辐射诱发的斑马鱼胚胎毒性，防止辐射诱发的神经丘毛细胞减少，认为其是防治辐射诱发耳毒性的安全有效候选药物。
六、再生药物研究
在组织器官再生研究中，与小鼠等模式动物相比，斑马鱼具有强大的再生能力，它的多个组织和器官如尾鳍、心脏、神经细胞、血管和肝脏等都能再生，为研究器官再生的调控机制提供了巨大优势。小分子化合物的高通量筛选在斑马鱼的研究中蓬勃发展，为研究者寻找影响器官发育与再生的有效药物，治疗相关的临床疾病提供了研究药物开发方向和信息。近年来通过转基因技术构建的转基因斑马鱼药物诱导模型，为通过大规模遗传筛选方法来深入研究再生的调节机制提供了可能。Fgf、Notch、Wnt等信号通路在心脏再生过程中的作用已被广泛认知。通过筛选提示Pdgf家族因子在心脏再生过程主要是再次激活心脏再生过程中的血管发生。视黄酸（RA）能够诱导鳍再生中的细胞凋亡。干扰哺乳动物胶原代谢的药物如消炎痛、阿司匹林等，可以干扰胶原纤维的沉积和组织，在TCDD处理后影响鱼鳍胶原的形成，再生过程受到抑制。此外，鱼类在医药学上的广泛应用与研究，也促使研究者们将鱼类直接作为药物来进行开发。纹鳢（Channastrtatus）作为ACE抑制剂、抗抑郁和神经再生剂的性能与在伤口治疗、作为止痛药的药效方面超越传统的治疗创伤与痛苦的药物处方。大鲵（Andriasdavidianus）机体中含有70多种天然活性物质，能改善人体细胞代谢水平，促进人体蛋白质合成，提高人体免疫功能，增强人体抗病能力，延缓衰老。因为大鲵特有的药用价值可将其深加工成烫伤药物、药用营养保健品、美容护肤品等。鲟鱼（AcipensersturioLinnaeus）的软骨可提取软骨素，皮、鳃和脂肪均具有特殊的药用价值。鲟鱼还具有抗癌、治癌的特殊功效。随着鱼类的药效被研究者发现，越来越多的鱼类将被用作药物来进行开发。
七、结语
综上所述，以实验鱼类进行药学研究已成为当今药学研究，特别是药物筛选的热门手段。但是目前药学研究可利用的标准实验鱼类品种（系）还相对较少。随着现代生物学技术的迅猛发展，特别是转基因技术、基因敲除技术、克隆技术、基因芯片等分子生物学技术在实验鱼类模型开发中得到广泛应用，会有越来越多的实验鱼类在珍稀药物筛选、药物疗效判定和新药临床前ADME/Tox评价，并在药物毒性检测与安全性评价中发挥更重要的作用。
作者：廖小立 姚峰 吴端生 单位：湖南衡阳南华大学药学与生物科学学院实验动物学部