2021-4-9 | 生物医学论文
材料与方法
1.材料：MCF-7细胞由本实验室保存；感受态大肠杆菌DH5α、BL21及质粒提取试剂盒、RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；DMEM培养基购自GIBCO生物公司；胎牛血清为杭州江滨公司产品；ImPro-II逆转录试剂盒购自Promega公司；限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ购自NEB公司；谷胱甘肽琼脂糖珠4B购自AmershamPharmaciaBiotechnology公司；辣根过氧化物酶标记的GST抗体、Cdc25C磷酸酶底物3-OMFP购自Sigma公司；引物合成和测序由北京奥科生物技术有限公司完成。
2.MCF-7细胞培养及总RNA提取：用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的DMEM培养基，于37℃、5%CO2培养箱中培养MCF-7细胞。收集MCF-7细胞，计数，在约5×106细胞中加入350μLRLT裂解液，充分混匀后加入等体积的70%乙醇，混匀并转移至RNA吸附柱中，8000r/min离心15s，弃上清液；加入700μLRW1液，8000r/min离心15s，弃上清液；加入500μLRPE液，8000r/min离心15s，弃上清液，重复1次；将吸附柱转移到一个新的2mL的离心管中，最大转速离心1min后加入30~50μL不含RNase的水，最大转速离心1min后，将RNA洗脱至1.5mL的EP管中。
3.RT-PCR扩增cdc25c基因：采用ImPro-II逆转录试剂盒，取1μgRNA为模板，以oligo（dT）15和随机引物逆转录合成cDNA（反应条件：25℃5min，42℃1h）。70℃、15min灭活反应体系中的逆转录酶和RNase抑制剂。以该cDNA为模板，以正向特异性引物5'-GCGGGATCCATGTCTACGGAACTCTTCTCATC-3'（含BamHⅠ酶切位点）、反向引物5'-ATTCCGCTCGAGTCATGGGCTCATGTCCTTCACC-3（'含XhoⅠ酶切位点）扩增cdc25c基因序列。将PCR扩增产物及载体pGEX-4T-1分别用BamHⅠ/XhoⅠ双酶切后连接，转化大肠杆菌感受态DH5α，筛选阳性克隆进行酶切鉴定。
4.GST-Cdc25C蛋白的诱导表达：将pGEX-GST-Cdc25C质粒转化大肠杆菌感受态BL21，接种至氨苄西林抗性的LB培养基中，37℃、200r/min培养至D600nm为0.6~0.8，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，12℃、200r/min培养6~8h，收获菌体，超声波低温破碎菌体，离心后取上清，加入4×SDS上样缓冲液［200mmol/LTris-HCl（pH6.8），8%SDS，4%溴酚蓝，40%甘油、10%β-巯基乙醇］，沸水浴5min，将样品进行SDS-PAGE。
5.GST-Cdc25C蛋白的纯化：在菌体上清中加入谷胱甘肽（GSH）琼脂糖珠4B，4℃旋转孵育2h，1000r/min离心，弃上清，用PBS缓冲液洗3次，备用；分别向结合GST的GSH琼脂糖珠、与GST-Cdc25C结合的GSH琼脂糖珠中加入1×SDS上样缓冲液［50mmol/LTris-HCl（pH6.8），2%SDS，1%溴酚蓝，10%甘油、2.5%β-巯基乙醇］，沸水浴5min，离心后取上清进行SDS-PAGE。
6.免疫印迹分析：SDS-PAGE结束后，将胶用半干转膜法转移到PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的PBST室温封闭1h，加入稀释的辣根过氧化物酶标记的GST抗体，室温孵育1h，用PBST洗膜3次，每次5min，最后将含有辣根过氧化物酶底物的ECL滴加到膜上，在暗室中进行X线胶片显影。
7.磷酸酶活性分析：在300μL磷酸酶反应缓冲液［50mmol/LTris-HCl（pH8.0），50mmol/LNaCl，1.0mmol/LEDTA，5mmol/LDTT，0.1%BSA］中分别加入1μg纯化的GST蛋白和GST-Cdc25C蛋白，随后加入Cdc25C的磷酸酶底物3-OMFP（终浓度150μmol/L），37℃温育，用荧光分光分度计在490nm激发光波长、530nm发射光波长处检测反应产物的荧光强度，荧光强度值的增加速率代表Cdc25C的磷酸酶活性。
结果
GST-Cdc25C融合表达质粒的构建：为了获得cdc25c基因，我们首先提取了MCF-7细胞总RNA，用RT-PCR逆转录获得MCF-7cDNA库，并用cdc25c特异性引物从cDNA库中扩增获得cdc25c基因，PCR产物电泳鉴定结果见图1。测序结果表明，该PCR产物序列与cdc25c基因序列（GenBankNo.BC019089）一致。随后，通过BamHⅠ和XhoⅠ限制性酶切位点将cdc25c基因的PCR产物克隆至pGEX-4T-1载体上，GST-Cdc25C融合表达阳性克隆双酶切鉴定结果如图1所示。
GST-Cdc25C融合蛋白的表达及纯化：用大肠杆菌BL21感受态细胞表达GST-Cdc25C融合蛋白，诱导表达条件为低温12℃、6~8h。收集菌体，于15mL冰浴的PBST（含蛋白酶抑制剂1片/25mL）中超声波破碎4min，使可溶性GST-Cdc25C融合蛋白释放到上清液中。SDS-PAGE结果表明，与GST对照组相比，在相对分子质量约87×103位置出现了显著条带（图2A），与GST-Cdc25C蛋白的相对分子质量一致，说明GST-Cdc25C在大肠杆菌BL21中获得了可溶性表达。随后，用GSH琼脂糖珠与裂解上清混匀，4℃旋转孵育2h，离心得到纯化的相对分子质量为87×103的GST-Cdc25C融合蛋白，并存在一定程度的降解。免疫印迹实验进一步表明，GST-Cdc25C融合蛋白及GST对照蛋白均获得表达及纯化（图2B）。
GST-Cdc25C的磷酸酶活性分析：以3-OMFP为Cdc25C磷酸酶反应底物，在磷酸酶活性反应体系中分别加入1μgGST和GST-Cdc25C融合表达蛋白，37℃温育，每隔5min用荧光分光分度计检测反应产物的荧光强度，荧光强度增加速率代表Cdc25C的磷酸酶活性。用荧光强度值相对时间变化绘图，结果如图3，与GST蛋白相比，加入GST-Cdc25C融合蛋白的反应体系的荧光值显著升高且速率稳定（基本呈线性），说明原核表达的GST-Cdc25C具有显著的稳定的磷酸酶活性。
讨论
在成功钓取人源cdc25c全长基因的基础上，我们表达纯化了具有磷酸酶活性的GST-Cdc25C融合蛋白。由于GST-Cdc25C在表达过程中容易形成天然二硫键，易导致包涵体的形成，且结构的不稳定增加，因此存在一定程度的降解。Cdc25C在调控细胞周期G2/M转换过程中有重要作用，其磷酸酶活性对于激活Cdc2/周期蛋白B复合体，开启细胞有丝分裂进程至关重要。目前发现的Cdc25C上游调节分子主要通过相互作用及磷酸化或泛素化修饰调节Cdc25C的磷酸酶活性及亚细胞定位，进而影响细胞周期的进程。本研究中，我们表达纯化出具有磷酸酶活性的GST-Cdc25C融合蛋白，为研究c-Abl酪氨酸激酶通过Cdc25C调控G2/M转换的分子机理提供了基础。（本文图略）
本文作者：张鹏 刘萱 曹诚 单位：北京军事医学科学院 生物工程研究所