2021-4-9 | 食品研究论文
目前对采用人工接种发酵生产桑叶茶及其对其中DNJ、黄酮、多糖、多酚等主要功能成分含量影响的研究鲜有报道。本文分别以4种菌单独或组合发酵桑叶制得的桑叶茶，分析其中DNJ、黄酮、多糖、多酚4种功能成分含量变化，为桑叶的深度开发利用提供数据。
材料与方法
1.实验材料
1）实验菌种：黑曲霉(AsPergillusniger)，GSICC60108，甘肃省微生物菌种保藏中心；日本根霉(RhizopusjaponicusVuillemin)，GIM3.119，广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心；绿色木霉(Trichodermaviride)，GIM3.443，广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心；青霉(Penicillium)，GSICC61603，甘肃省微生物菌种保藏中心。以上四种菌种的安全等级均高，其生物危害程度为四类，在通常情况下不会引起人类或者动物疾病。
2）实验样本：自然发酵桑叶茶、人工发酵桑叶茶由本实验室自制。
2.试剂与仪器
1）主要试剂：DNJ标准品，北京德威钠生物技术有限公司；甘氨酸（Gly），sigma公司；9-芴基氯甲酸甲酯（FMOC-Cl），sigma公司；乙腈为色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司；没食子酸标准品，中国药品生物制品检定所；芦丁标准品，北京德威钠生物技术有限公司；其他常用试剂均为分析纯。
2）主要实验仪器：Waters1525HPLC，美国Waters公司；5810型台式高速离心机，德国Eppendorf公司；Spectrumlab22可见分光光度计，上海棱光技术有限公司；KQ5200DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。
3.实验方法
1）发酵桑叶茶的制备：采摘从顶芽往下数4-10片的新鲜桑叶，去柄，切为4cm×4cm的小叶片，混匀后称取100g叶片用微波杀青90s，揉捻，加入107cfu菌液10mL(自然发酵只加10mL无菌水)，复揉，28℃发酵5h，微波干燥，制得桑叶茶。（注：加菌量共为107cfu，菌种复配比例为1:1或1:1:1。）2）DNJ的测定测试样品的制备：取桑叶茶粉末0.5g，加入一定量超纯水，80℃水浴浸提2h(每20min摇匀一次)，抽滤后，滤渣再加水浸提2次。合并浸提液，用超纯水定容至50mL，即得样品提取液。DNJ的衍生化及测定方法按照参考文献[19]进行。色谱条件：色谱柱：C18柱（150mm×4.6×5μm）；流动相：乙腈-0.1%醋酸(50:50，V/V)；流速：1.0mL/min；柱温25℃；进样量10μL；紫外检测器，检测波长254nm。3）黄酮测定：取桑叶茶粉末0.5g于50mL离心管中，加70%乙醇15mL，80℃水浴80%功率超声提取15min，7000r/min离心5min，抽滤，得到滤液。如此共提取3次，滤液用70%的乙醇定容至50mL。吸取1.0mL滤液，用AlCl3比色法[20]测定4）多糖测定：取桑叶茶粉末0.250g于兰盖瓶中，加入20mL沸蒸馏水，在100%功率下55℃超声提取20min，将提取液过滤后定容至25mL。取1.0mL滤液用苯酚-硫酸法[21]测定多糖含量。5）多酚测定：按照GB/T8313-2008茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法[22]进行测定。
4.数据统计与分析：各实验至少重复3次以上，实验数据用Excel和Spss16进行统计处理。
结果和讨论
1.各活性成分标准曲线线性回归方程及相关系数
按照3.2）的实验方法，对不同浓度DNJ标准溶液进行测定，得到DNJ的标准曲线线性回归方程为y=15776x-70392，相关系数r=0.9996。式中x为DNJ浓度，μg/mL；y为峰面积。按照1.3.3实验方法，测定不同浓度芦丁标准溶液的吸光度，得到芦丁标准曲线线性回归方程为y=11.622x-0.0031，相关系数r=0.9997。式中，x为芦丁浓度，μg/mL；y为吸光度。按照1.3.4的实验方法，测定不同浓度葡萄糖标准溶液的吸光度，得到葡萄糖的标准曲线线性回归方程为y=10.909x-0.0021，相关系数r=0.9998。式中，x为葡糖糖的浓度，μg/mL；y为吸光度。按照1.3.5的实验方法，测定不同浓度没食子酸标准溶液的吸光度，得到没食子酸的标准曲线线性回归方程为y=0.0208x+0.0034，相关系数r=0.9998。式中，x为没食子酸的浓度，μg/mL；y为吸光度。实验结果表明，各标准曲线的相关系数均大于0.9990，线性关系良好，可用于样品中相关活性成分的测定。
2.DNJ标准品和样品的色谱图
将DNJ经衍生化后上高效液相色谱仪进行测定，得到如图1、图2、图3所示色谱图：由色谱图2可知，在本实验条件下，DNJ衍生物DNJ-FMOC的保留时间为2.731min，与Gly-FMOC和FMOC-OH的峰间距分别相差2.719min和4.243min，表明这两种物质均不干扰DNJ的测定。
3.单一菌种发酵桑叶茶中DNJ等活性成分含量变化
分别以黑曲霉、日本根霉、绿色木霉和青霉的单一接种于桑叶中进行发酵生产桑叶茶，与自然发酵生产的桑叶茶比较其DNJ等活性成分含量的变化。实验结果如表1：从表1可知，用绿色木霉发酵所得桑叶茶中DNJ含量为111.28mg/100g.干重，与自然发酵得到的桑叶茶比较，下降了6.43%，且有显著性差异（P＜0.05）；而日本根酶、黑曲霉、?霉发酵后得到的桑叶茶中DNJ含量均上升，特别是日本根酶发酵后DNJ含量为131.56mg/100g.干重，与自然发酵的桑叶茶比较增加10.63%，具有极显著差异（P＜0.01）。与自然发酵比较，4种单一菌种发酵桑叶茶中多糖含量均下降，其中黑曲霉、青霉、绿色木霉发酵的桑叶茶中多糖含量与自然发酵的比较分别下降了14.48%、8.84%、9.18%，均具有极显著性差异（P＜0.01）；而日本根霉发酵桑叶茶中多糖仅下降了2.67%，无显著性差异（P＞0.05）。与自然发酵比较，用日本根霉发酵桑叶茶中黄酮增加了5.78%，有极显著性差异（P＜0.01）；而黑曲霉、青霉、绿色木霉3种菌发酵桑叶茶中黄酮含量分别降低了23.77%、0.86%、14.73%，其中黑曲霉、绿色木霉发酵的桑叶茶中黄酮下降有极显著差异（P＜0.01）；而?霉发酵后黄酮含量下降无显著性差异（P＞0.05）。与自然发酵比较，用日本根霉、黑曲霉、青霉、绿色木霉发酵桑叶茶中的多酚含量分别降低了9.00%、33.56%、11.74%、24.56%，其中日本根霉发酵桑叶茶中多酚含量下降相对较少，但也有显著性差异（P＜0.05），而黑曲霉、青霉、绿色木霉发酵的桑叶茶中多酚含量下降有极显著性差异（P＜0.01）。综合单一菌种发酵实验的结果可知，与自然发酵比较，采用日本根霉发酵后所得桑叶茶中DNJ、黄酮含量有极显著增加；而多糖、多酚含量虽然有所下降，但比实验的其他菌种发酵后桑叶茶中这两种成分的下降低很多。因此，从对发酵桑叶茶功能成分影响来看，单一菌种发酵以日本根酶较好。