2021-4-9 | 食品研究论文
蛋白质的体外消化模型
蛋白质是食品的重要成分之一，涉及到的蛋白质消化酶及消化条件有比较好的研究基础，且相对明确，因此，针对蛋白质的体外消化模型研究的最早，相关的研究和应用报道也较多。
1.蛋白质体外消化模型建立的主要依据
消化蛋白质的酶主要是蛋白酶，食物经过口腔的咀嚼，经由咽、食管、进入胃、小肠中，在蛋白酶比较丰富的胃肠开始消化过程。体外实验中酶的浓度、反应温度、pH、时间及抑制剂、激活剂都是影响蛋白质消化的重要因素，且消化不同食物来源的蛋白质的酶种类不同，它们刺激肠胃产生的酶量不同、所需消化时间也不同。在模拟消化的过程中，一般模拟的部位主要是胃和小肠，在胃中水解蛋白质的胃液主要由胃蛋白酶和胃酸组成。小肠中的蛋白质消化相对复杂，由胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和肽酶、羧肽酶 A、B 等组成，可将经胃消化所得的肽或蛋白质进一步水解为氨基酸和小肽。蛋白质体外消化模型一般以蛋白质的消化率为测定参数，消化率是动物从食物中所消化吸收的蛋白质占总摄入量的百分比，是评价食物营养价值的重要指标。Abdel-Aal[6]研究表明，蛋白酶的种类及酶作用顺序和过程会对蛋白质的消化率产生影响。他们用三种酶（胰蛋白酶、糜蛋白酶、肽酶）同时消化蛋白质，对比两种酶（胃蛋白酶和胰液素）分两步消化蛋白质，就蛋白质的消化率而言，发现前者比后者高 39-66%。席鹏彬等[7]在研究菜粕的体外消化中也发现，如果用胰酶制剂代替胃蛋白酶-胰蛋白酶两步酶解过程中的胰蛋白酶可使菜粕干物质和粗蛋白质的消化率分别提高 5.2%和 11%。所以，复合酶体系更符合体内的消化状况[1]。另外，摄食的蛋白量增大会引起胰液素蛋白酶的分泌增多，同样地，淀粉和脂质的摄入量增加会分别引起唾液淀粉酶和酯酶分泌增多，即食物组成和摄入量的不同会引起相应的酶分泌增加或减少，建立体外消化模型时也需考虑这方面的因素。单酶法可用来预测单个物质的可消化性，例如，淀粉的消化主要用淀粉酶，脂质的消化主要用脂肪酶、蛋白质消化用蛋白酶[1]。单酶消化法要比运用复合酶消化更有利于消化模型的标准化，但实际上，食用物质中各种营养物质相互作用，彼此间相互影响，所以就实用性而言，复合酶体系占优势[2]。
2.体外消化模型在食物蛋白质研究中的应用
近十年来被用于蛋白质营养代谢、生理活性、过敏原检测等方面研究的体外消化模型中，主要以谷物类蛋白，奶制品中的蛋白质，以及水产品和一些果蔬中的蛋白质为研究对象。谷物类作为人们食物的主要来源，其蛋白质是主要研究对象，如对小麦蛋白[6]、大豆蛋白[8]、菜粕粗蛋白[9]等都有研究。在这些体外消化模型中，所采用的消化酶主要是胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰液素，牛奶作为膳食中蛋白质的主要来源之一也是蛋白质体外消化模型的主要研究对象，如对牛奶蛋白[10]、山羊奶蛋白[11]、牛乳清蛋白[12]、瑞士干酪[13]、β-乳球蛋白[14]的研究。上述体外消化模型因研究对象和目的不同，采用的消化酶组成和 pH 也不尽相同。例如在研究牛乳清蛋白时，研究者首先模拟胃部消化环境，在体外采用猪胃蛋白酶、牛科动物的凝乳蛋白酶、胃蛋白酶以及不同 pH 的小鼠胃液对牛乳清蛋白进行消化，结果表明在不同消化酶的作用下 α-乳白蛋白和牛血清白蛋白被水解了而 β-乳球蛋白在不同的消化酶和不同 pH 作用下都没能水解，可见加热变性的乳清蛋白包括 β-乳球蛋白都被胃蛋白酶彻底水解了。在进行体内试验时出现了与体外试验相同的结果，天然的 β-乳球蛋白在小鼠体内未能消化但是加热变性的 β-乳球蛋白却在小鼠胃内消化了，与胃部体外模拟实验结果一致。接着，研究者在体外模型和小鼠体内分别研究蛋白质在肠中的消化，在体外用胰液素去消化天然的和变性的 β-乳球蛋白，二者都被消化了，同时将在胃中不消化的天然的 β-乳球蛋白注射到小鼠胃内，这些天然的β-乳球蛋白进入小肠后也被消化了，这与体外结果也是一致的。这个实验表明体外建立模型模拟蛋白质的消化可以较好的反应体内真实的消化状况，将其作为蛋白质消化研究的方法和工具是可行的。
3.体外消化模型在活性寡肽研究中的应用
随着生物活性寡肽研究的深入，关于活性肽的消化研究也逐步展开。摄入蛋白质不仅是人体需要的营养物质氨基酸的重要来源，还扮演着生物活性肽的重要角色，体外模型对活性肽消化和活性的评价已有应用的先例。目前报道较多的是消化模型应用于 ACE 酶抑制活性肽的研究。有研究者在体外用 pH 在 2～3 之间的胃蛋白酶液和 pH 在 7～8 之间的胰液素消化瑞士干酪[15]，结果发现经消化后的蛋白产物的 ACE酶抑制活性发生了变化。高分子量的蛋白质消化后会产生一些新的活性肽，加强对 ACE 酶的抑制，而原本具有一定 ACE 酶抑制作用的 10ku 的肽却被消化了，这又降低了产物的 ACE 酶抑制活性，研究结果表明消化带来的蛋白和肽的结构变化，将与其体外活性测定的结果有所差别，高活性的物质也许经过消化后，其活性中心被影响，导致活性降低，而低活性的物质，经过消化后也许活性片段将暴露，活性反而更高。因此，传统的简单的体外活性筛选不能完全反应它们在体内经消化后的活性状况，结合消化模型对活性进行综合评价是十分必要的。同类研究还有用胃蛋白酶-胰液素联合消化大豆蛋白[10]或鲣鱼[16]蛋白，研究其产物的 ACE 酶抑制活性。体外消化模型也有用于抗氧化肽研究的报道，我国学者王兴等[17]人通过体外模拟部分胃、肠道消化过程，考察苦荞蛋白经胃、肠道消化后生成肽的组成及其抗氧化活性，揭示了苦荞蛋白质体内消化与抗氧化活性的关系。研究结果显示苦荞蛋白质经模拟消化 10h 后产生最高抗氧化活性多肽，凝胶分离出 5 个组分，其中分子质量为 900u 的肽具有最强的抗氧化活性。生物活性肽在人体内发挥着重要作用，活性肽进入人体后的消化产物是多样的，只有能在体内环境下保留某些特征结构或者释放特征结构的肽分子才会在人体内发挥重要功能。因而，采用体外消化模型进行活性肽的筛选和评价，不仅可以缩短研究时间，减少研究费用，同时也是更为准确和合理评价其活性所必需的，对于生物活性肽食品、药品的开发有重要意义。
4.体外消化模型在过敏原研究中的应用
蛋白质体外消化模型还被应用于过敏原等对人体有重大潜在危害的蛋白或肽类物质的检测中。如对猕猴桃过敏原[18]、鲤鱼过敏原[16]的研究。一些研究者通过模拟肠胃液消化试验，分析锯缘青蟹肌肉中过敏原（原肌球蛋白）的消化特性以及消化对过敏蛋白致敏性的影响，结果表明蟹类过敏蛋白相对于非过敏蛋白具有较高的消化稳定性，而且其高分子质量降解产物仍可能引起过敏反应[19]。试验采用模拟胃、肠液环境，以 SDS-PAGE 和Westernblot 进行分析，对青蟹原肌球蛋白和肌原纤维蛋白在体外模拟肠胃环境中的消化稳定性进行了测定。在模拟胃液反应中，非过敏原蛋白尤其是肌球蛋白重链和肌动蛋白可被胃蛋白酶快速降解，而过敏原蛋白原肌球蛋白在 60min 时仍未被完全分解。在模拟肠液反应中，相对于致敏蛋白，肌球蛋白重链、肌动蛋白等非过敏蛋白在较短的时间内被分解，原肌球蛋白尽管 120min 后几乎被完全分解，但会产生一些较稳定的蛋白降解片段，而且其中一些分子质量为 34ku 的原肌球蛋白降解产物仍具有过敏原性。体外模型的应用为过敏原的研究提供了简便实用的工具。除上述研究外，还有大量的应用体外消化模型对动植物蛋白进行研究的报道，如对海藻蛋白[20]、肌原纤维蛋白[21]、肉类蛋白[22]、抗高血压三肽[23]以及其它动物副产品蛋白的研究。由此可见，作为应用较早的体外消化模型，蛋白质体外消化模型已经开始在蛋白质的各类研究中发挥重要作用。