低聚糖对乳酸菌抗氧化胁迫的影响研究

材料与方法

1.材料与仪器

保加利亚乳杆菌（L.bulgaricusFn009）本实验室保存；GOS、XOS本实验室提供；PI（碘化丙啶）sigama公司；DTNB（二硝基苯甲酸）sigama公司；H2O2、Vc（抗坏血酸钠）、FeSO47H2O、Na2HPO412H2O、NaH2PO42H2O、MTT（噻唑蓝）、二甲亚砜、柠檬酸三钠、叠氮钠、GSH（还原型谷胱甘肽）、偏磷酸等试剂均为国产分析纯。总超氧化物酶歧化酶（T-SOD）试剂盒南京建成生物工程研究所。Delta320pH计上海梅特勒-托利多仪器有限责任公司；FA1004A电子天平上海精天电子仪器有限公司；超级恒温水浴箱上海市化学仪器总厂；5804R型台式高速冷冻离心机德国艾本德生物技术有限公司；QL-901漩涡混匀器江苏海门其林医用仪器厂；MultiskanMk3酶标仪美国Thermo公司；立式自动电热压力蒸汽灭菌器上海申安医疗仪器仪表厂；超净工作台苏净集团安泰公司；FACSCalibur流式细胞仪美国BD公司；隔水式恒温培养箱上海市跃进医疗器械厂；微量分光光度计spectrophotometer上海琪特分析仪器有限公司；7900HTfast实时荧光定量PCR仪美国ABI公司。

2.实验方法

1）.乳酸菌活化：实验室甘油保存（-70℃）的乳酸菌接种到MRS琼脂培养基活化，挑取单菌落接种于MRS液体培养基深层培养过夜（18h，37℃）。2).乳酸菌耐H2O2能力的测定：收获培养至12h的乳酸菌菌体，利用磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）清洗三次，重新悬浮在PBS中调整菌体浓度至107CFU/mL。取5mL菌悬液沸水浴15min，制备死菌悬浮液作为阴性对照组。按表1加入试剂，37℃孵育，每隔2h取100μL菌悬液加入96孔板，加入5mg/mL的MTT20μL，振荡混匀37℃反应2h，加入100μL二甲亚砜混匀后测定OD570nm吸光度。3).FCM检测乳酸菌细胞膜完整性：乳酸菌在MRS培养基上发酵至对数中期，收集菌体，调整浓度至106CFU/mL。实验分组及试剂添加顺序同表1（H2O2终浓度：2mM；低聚糖终浓度为20mg/mL），置于37℃孵育2h后离心收集沉淀，加入PI溶液，终浓度为50μg/mL，冰浴避光染色30min，上流式细胞仪测定，在488nm激发光激发下，波长630nm处检测荧光信号。以相同浓度活菌悬液设“门”，FL2-H表示荧光强度，Counts表示细胞频数，M1表示细胞膜完整的细胞比率，M2表示细胞膜破损的细胞比率，每个样品收集10000个细胞，用CellQuest软件进行数据分析。4).乳酸菌抗氧化酶活测定：配制新鲜的MRS培养基记为H2O2组，以GOS和XOS分别取代20%葡萄糖的MRS培养基记为H2O2+GOS组和H2O2+XOS组；在MRS培养基中添加0.01%Vc记为H2O2+Vc组，分别接种1%乳酸菌，培养3h后，添加H2O2（终浓度：2mM）建立氧化应激模型，以不添加H2O2的MRS为正常组。发酵至对数中期，4800r/min离心10min，收集菌体，用PBS清洗三次，调整菌体浓度为108CFU/mL，300W冰浴超声破碎10min，破碎液10000r/min离心10min，收集上清，即为无细胞提取物。按照T-SOD试剂盒说明书测定乳酸菌无细胞提取物超氧化物歧化酶活力（U/mgprot），利用DTNB直接显色法[7]测定无细胞提取物的GSH-Px酶活力（U/mgprot），蛋白浓度采用考马斯亮蓝法[8]进行测定。5).乳酸菌应激蛋白基因表达的测定：收集1.2.4氧化应激模型中发酵至对数中期的乳酸菌菌体，利用121℃灭菌的DEPC（焦碳酸二乙酯）水洗涤三次，4800r/min离心10min，收集菌体，提取RNA。利用荧光定量PCR技术检测氧化应激状态下低聚糖对三株乳酸菌抗氧化胁迫基因和通用应激蛋白基因表达水平的影响。本实验所选相关基因的引物由上海捷瑞公司设计并合成，引物序列见表2。6).数据处理与统计分析使用：SPSS17.0软件进行单因素方差分析、用Turky法进行多重比较和差异显著性检验，结果以平均数标准偏差（XSD）表示。

结果与分析

1.低聚糖对乳酸菌抵抗H2O2能力的影响：过氧化氢是研究氧化胁迫的常用介质，乳酸菌对H2O2具有较高的敏感性，近期研究发现，保加利亚乳杆菌极易遭受H2O2或其他活性氧（ROS）攻击，形成氧化损伤，造成生长停滞甚至死亡[9-10]。图1显示，乳酸菌在H2O2胁迫下，活菌率不断下降，H2O2孵育8h后活菌率下降至20%左右。GOS和XOS干预6h后乳酸菌活菌率显著高于相同时间点的H2O2组（p<0.05），但仍显著低于正常组（p<0.05）。说明GOS和XOS能够增强乳酸菌对H2O2胁迫的抗逆性，提高氧化胁迫条件下的存活率。

2.氧化胁迫条件下低聚糖对乳酸菌细胞膜完整性的影响：乳酸菌遭受氧化胁迫时，细胞膜上的蛋白质、脂类等容易发生氧化损伤，细胞膜的完整性和功能性遭到破坏，最终导致菌体死亡。图2显示，正常组菌体细胞膜完整率为98%，死菌悬液设置的阴性对照组细胞膜破损比率为97%，H2O2组乳酸菌PI染色率高达79%，细胞膜完整菌体的比率仅为17%，说明H2O2胁迫能够造成乳酸菌细胞膜氧化损伤，细胞完整性受到破坏。GOS和XOS干预组，乳酸菌细胞膜完整率分别为34%和30%，较H2O2组分别提高了17%和13%。从以上数据可以看出，GOS和XOS干预能够减弱H2O2对乳酸菌细胞膜的氧化损伤程度，对菌体细胞膜具有保护效应。

3.氧化胁迫条件下低聚糖对乳酸菌抗氧化酶活力影响图：3表明，H2O2组乳酸菌的谷胱甘肽过氧化物（GSH-Px）和总超氧化物歧化酶（T-SOD）活力较正常组显著下降（p<0.05），说明H2O2胁迫能够造成乳酸菌抗氧化酶活力的显著下降（p<0.05）。GOS和XOS干预后乳酸菌GSH-Px活力较H2O2组均有所升高，但XOS干预组差异不显著（p>0.05），两者仍低于Vc干预组和正常组；GOS和XOS干预后乳酸菌的T-SOD活力较H2O2组显著升高，但仍显著低于Vc干预组和正常组（p<0.05）。说明氧化胁迫条件下，GOS和XOS干预能够提高乳酸菌的抗氧化酶活力，但低聚糖作用效果低于Vc。
2.4H2O2胁迫下低聚糖对乳酸菌应激蛋白基因表达水平的影响：乳酸菌在遭受环境胁迫（如极端温度、pH、渗透压、氧和饥饿等）时，会启动相应的应激感应系统和应激防御系统，诱导相关基因进行调节[11]，产生应激保护作用，这些应激反应可以提高乳酸菌在环境胁迫下的存活能力。对乳酸菌的蛋白质组学研究表明，乳酸菌在环境胁迫时可以诱导产生多种应激蛋白，其中Dnak、GroEL和Gsp65伴侣蛋白可以被多种胁迫条件所诱导[12-13]，属于通用应激蛋白，能够参与DNA和蛋白质修复。损伤修复是抵抗氧化和其他胁迫的基本机制[14]。图4表明，在H2O2胁迫条件下，乳酸菌的应激蛋白基因表达量较正常组显著提高（p<0.05），其中，Dnak热激蛋白基因表达量上调近80倍，GroEL和Gsp65应激蛋白基因表达量分别上调了20倍和13.3倍，说明H2O2胁迫能够导致乳酸菌应激蛋白基因显著上调（p<0.05）。GOS和XOS干预后三种应激蛋白基因的表达量较H2O2组显著降低（p<0.05），但仍显著高于正常组（p<0.05），说明GOS和XOS能够减弱H2O2对乳酸菌的氧化胁迫程度，降低乳酸菌的氧化应激反应。