苦瓜藤多糖提取流程探析

作者：曾哲灵 奚光兴 葛晓环 单位：南昌大学食品科学与技术国家重点实验室 南昌大学环境与化学工程学院 南昌大学生命科学与食品工程学院

1材料与方法

1.1材料与仪器苦瓜藤购自农村；牛血清蛋白购自美国Sigma公司；葡萄糖、考马斯亮蓝G-250、磷酸、苯酚、浓硫酸、盐酸溶液、氢氧化钠、无水乙醇等试剂皆为国产分析纯。KQ5200E型超声波清洗器（40KHZ，200W）昆山超声仪器有限公司；HH恒温水浴箱中大仪器厂；765pc型紫外-可见分光光度计上海光谱仪器有限公司；R系列旋转蒸发仪上海申生科技有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵郑州长城科工贸有限公司

1.2实验方法

1.2.1苦瓜藤多糖的提取工艺流程新鲜的苦瓜藤晒干后，剪成2~3cm的小段，粉碎机粉碎，60℃条件下烘干至无游离水，取一定量的苦瓜藤藤粉末，按一定条件超声波提取后，离心取上清液，过滤，50℃真空旋转浓缩提取液，加入4倍体积的无水乙醇，4℃下醇沉8~12h，醇沉两次，离心，乙醚洗涤，烘干，得苦瓜藤粗多糖。

1.2.2葡萄糖标准曲线的制备[14-15]准确称取105℃烘至恒重的葡萄糖标品1g，蒸馏水定容至1L，移取2mL，用25mL的容量瓶定容，得0.08mg/mL葡萄糖标液。分别吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL葡萄糖标液于25mL比色管中，补足蒸馏水至2.0mL，加1.0mL6%苯酚，再加入5.0mL浓硫酸，摇匀，静置冷却至室温，在490nm处测定吸光度值。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。葡萄糖含量与吸光度值经回归处理，回归方程为：A=14.373C-0.0133，R2=0.9969(n=8),糖含量在8～64μg线性良好，见图1。

1.2.3苦瓜藤多糖得率的测定[16]取提取液上清液，过滤，定容至250mL，分别吸取0.1mL提取液，补足水至2.0mL,测定吸光度值，根据测得的吸光度值A，参照葡萄糖标准曲线，计算出多糖浓度，进而得到得率。

1.2.4超声波提取单因素实验

1.2.4.1提取温度准确称取5.0g苦瓜藤粉末5份，料液比为1:40(g/mL)，pH为7，分别取30、40、50、60、70℃，超声提取20min，离心取上清液，过滤，计算多糖得率，每个因素做四个平行。

1.2.4.2料液比准确称取5.0g苦瓜藤粉末5份，温度为60℃，pH为7，料液比分别为1:20、1:30、1:40、1:50、1:60(g/mL)，超声20min，余下操作如1.2.4.1。

1.2.4.3提取时间准确称取5.0g苦瓜藤粉末5份，温度为60℃、料液比1:30(g/mL)，pH为7，分别超声10、20、30、40、50min，之后操作如1.2.4.1。

1.2.4.4pH准确称取5.0g苦瓜藤粉末5份，温度60℃、料液比1:30(g/mL)、超声时间30min，研究不同pH条件3、5、7、9、11下的多糖提取得率，余下操作如1.2.4.1。

1.2.5苦瓜藤多糖超声波提取的正交实验设计[17]在单因素实验的基础上进行L9(34)正交实验，因素水平表见表1。

1.2.6热水提取法单因素实验设计热水提取法单因素实验，并优化工艺，比较分析两种提取方法的优劣。以料液比、提取时间、提取温度这3个单因素为研究目标。

1.2.6.1料液比准确称取5.0g苦瓜藤粉末5份，温度70℃，料液比分别为1:20、1:30、1:40、1:50、1:60(g/mL)，热水提取90min，之后操作如1.2.4.1。

1.2.6.2时间准确称取5.0g苦瓜藤粉末5份，温度70℃、料液比1:50(g/mL)，分别浸提30、60、90、120、150min，之后操作如1.2.4.1。

1.2.6.3温度准确称取5.0g苦瓜藤粉末5份，料液比1:50(g/mL)、浸提时间90min，分别在50、60、70、80、90℃条件下提取，之后操作如1.2.4.1。

1.2.7苦瓜藤多糖热水提取的正交实验设计根据单因素实验结果，设计L9(33)正交实验，因素水平表见表2。

1.2.8超声波提取法与热水提取法的比较分别取5.0g苦瓜藤粉末2份，分别用超声波与热水提取的最佳工艺各提取2次，测定其多糖浓度，得出多糖得率，比较两种方法的提取效率。

1.3统计分析各组实验数据平行4次，结果以平均值±标准偏差的形式表示。数据采用GraphPadPrism（5.01版）进行分析，结果显示单因素数据的p值<0.05，具有统计显著性。采用正交助手Ⅱ（3.1版）对正交实验结果进行直观、极差和显著性分析。

2结果与分析

2.1超声波提取实验结果

2.1.1单因素实验结果

2.1.1.1提取温度对苦瓜藤多糖得率的影响由图2可见，苦瓜藤多糖得率随着温度的升高而上升，但到达60℃时趋于平缓，考虑到在高温下部分多糖分子会发生键的断裂，结构破坏，其活性会遭到破坏。同时过高的温度对设备要求较高，耗能大，故温度选在60℃为宜。

2.1.1.2料液比对苦瓜藤多糖得率的影响由图3可知，苦瓜藤多糖的得率随着料液比先增高后下降，在1:30(g/mL)达到最大。1:30(g/mL)以后提取率下降的原因，可能是料液比过大,会增加超声波破碎细胞的阻力,使细胞破碎程度下降,降低多糖的提取率;如果料液比过小,又没有足够的水溶解出苦瓜藤多糖,也会使提取率降低[18]。故料液比宜取1:30(g/mL)。

2.1.1.3超声时间对苦瓜藤多糖得率的影响由图4可知，随着时间的增长，提取率逐渐上升，到30min时达到最大，时间再增加时提取率又会下降，造成这一现象的原因可能是超声波作用的时间过长,也会使得部分多糖的高分支结构受到破坏,使其溶于水的特性消失[18]，从而降低了多糖提取率。故时间宜取30min。2.1.1.4pH环境对苦瓜藤多糖得率的影响由图5可见，多糖得率随着pH增加而升高，可见多糖在酸性环境下不稳定，结构易变化，或分解，造成提取率降低，而在碱性环境下比较稳定，但是，过碱的环境对多糖的品质会有一定的影响，且多糖得率从pH为7时增幅就不大，故pH宜取7。

2.1.2超声波提取正交实验结果超声波提取苦瓜藤多糖正交实验结果见表3。由表3可知，四因素对苦瓜藤多糖得率的影响大小为：温度>超声时间>pH>料液比。其最佳提取工艺参数为A3B3C3D3，但由于pH和料液比为次要因素，为节约成本考虑，调整pH为7，料液比为1:30(g/mL)，其组合为A3B2C3D2。与A3B3C3D3做验证性比较，结果表明，A3B2C3D2的得率为2.36%，A3B3C3D3得率为2.38%，而表中A3B1C3D2的得率为2.35%。由此可见，从提取率和能源节约两方面综合考虑，A3B1C3D2可为最优提取工艺。根据最优提取工艺分别提取1、2、3次，结果表明，一次提取率为2.36%,两次提取混合液为提取率为3.08%，三次提取混合液为3.44%，三次提取增幅很小，出于经济因素考虑，取2次提取为宜，因此，超声提取苦瓜藤多糖的最优工艺为：提取温度65℃、料液比1:25(g/mL)、超声时间35min、pH为7，浸提2次。