梨幼果多酚提取工艺优化

作者：赵梅 张绍铃 齐开杰 衡跃进 陶书田 单位：南京农业大学梨工程技术研究中心 宝应县奕佳农牧有限公司

实验方法

挑选健康的幼果，去皮去核，果肉切成小块，液氮研磨成粉末，称取一定质量的粉末，按一定的提取条件在恒温摇床中匀速浸提，将粗提液离心过滤后，测定并计算多酚得率。梨幼果多酚含量的测定采用福林酚法（Folin-Ciocalteu）[6]测定，以没食子酸为基准物质，计算梨幼果多酚含量。回归方程为y=8.5095x+0.0111，R2=0.9984。梨幼果多酚得率的计算多酚得率/(mg/g)=C×V×N/m，式中：C为提取液中多酚质量浓度/(mg/mL)；V为提取液体积（mL）；N为稀释倍数；m为梨幼果果肉质量（g）。梨幼果多酚提取的单因素试验选取乙醇浓度、提取时间、提取温度、提取料液比为影响因素，进行单因素试验。

乙醇浓度对梨幼果多酚得率的影响采用不同的乙醇浓度10%、30%、50%、70%、90%，固定提取时间5h，提取温度60℃，提取料液比1:20（g/mL），研究不同乙醇浓度对梨幼果多酚得率的影响。提取时间对梨幼果多酚得率的影响采用不同的提取时间2、4、6、8、10、12h，固定乙醇浓度50%，提取温度60℃，提取料液比1:15(g/mL)，研究不同提取时间对梨幼果多酚得率的影响。提取温度对梨幼果多酚得率的影响采用不同提取温度20、40、60、80、100℃，固定乙醇浓度50%，提取时间1.5h，料液比1:20（g/mL），研究不同提取温度对梨幼果多酚得率的影响。

料液比对梨幼果多酚得率的影响采用不同提取料液比1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30，固定乙醇浓度50%，提取时间5h，提取温度60℃，研究不同提取温度对梨幼果多酚得率的影响。梨幼果多酚提取的正交试验在单因素试验的基础上，进一步考察乙醇浓度、提取时间、提取温度、提取料液比对梨幼果多酚得率的影响，设计4因素3水平L9（34）的正交试验。梨幼果酚类物质HPLC分析提取物经过0.45μm微滤膜过滤后，利用色谱仪进行测定。高效液相色谱分析条件[4]：色谱柱，C18柱150mm×4.6mm，Φ5μm；流动相，甲醇和水；柱温，30℃；流速，0.6mL•min-1；进样量，5μL；紫外检测器，波长280nm。流动相A：水，用磷酸调pH3.2；B：甲醇。线性梯度淋洗程序，时间（min）/B（%）：0/2，3/2，4/25，11/50，16/80，26/80，30/2，35/2。数据统计分析利用Excel和SPSS17.0统计软件对获得的数据进行统计分析。

结果与分析

1提取条件的单因素试验

1.1乙醇浓度对梨幼果多酚得率的影响由图1可以看出乙醇浓度低于70%时，随着乙醇浓度增加，梨幼果多酚得率也逐渐提高；乙醇浓度高于70%时，多酚得率随着乙醇浓度的增加而下降。乙醇浓度过低，多酚得率低，可能是因为多酚类物质在植物体内通常与蛋白质、多糖等以氢键和疏水键形成稳定的分子复合物，而水断裂氢键的作用较弱，提取液中水的比例过高时，不足以破坏样品中多酚类物质与蛋白、多糖或其他物质的连接，多酚得率低[7]；乙醇浓度过高，多酚得率低，可能是因为溶出较多醇溶性杂质、色素、亲脂性较强的成分，这些成分与多酚类化合物竞争同一乙醇水分子[8]。乙醇浓度为50%和70%时，多酚得率之间没用显著性差异，考虑到工业成本，确定最佳乙醇浓度为50%。

1.2提取时间对梨幼果多酚得率的影响如图2所示，当提取时间达到4h，多酚得率最高，继续延长提取时间，多酚得率开始下降。这是因为随着时间加长，可以使多酚充分溶解于溶剂中，但时间过长会因为温度的影响发生降解、缩合、氧化等化学反应[9]。此外，时间越长，耗能越大[10]，故选择最佳提取时间为4h。

1.3提取温度对梨幼果多酚得率的影响由图3可知在所设计的温度范围内，多酚得率随温度的升高而呈增大趋势。在20～40℃之间，多酚得率上升速率最慢，40～60℃之间，多酚得率的升高最明显，60～100℃之间，多酚得率的增量有所下降。可能是由于随着温度的升高，一方面有利于未游离出来的多酚的浸出[11-12]，另一方面，也促进已经提取出来的多酚的氧化与降解[13]。故综合考虑选择最佳提取温度为60℃。

1.5料液比对梨幼果多酚得率的影响由图4可以看出，随着料液比的增大，多酚得率逐渐增加,当料液比到达1:25以后，料液比继续增大，多酚得率增加缓慢。这可能是由于料液比为1:25时，溶剂已经能将梨幼果中多酚提取出来，继续增加料液比，并不能显著提高多酚得率。而且料液比过高，不利于回收，且造成浪费。因此，从提取效果、经济角度方面考虑，料液比选择1:25较为合适。

2正交试验优化梨幼果多酚提取条件

通过各因素的极差R（表2）比较发现RB>RA>RD>RC，极差R越大，其对应因素对梨幼果多酚得率影响越大。因此，本试验影响因子的先后顺序为提取温度>乙醇浓度>提取料液比>提取时间。将极差最小的因素（提取时间）作为误差项，方差分析（表3）进一步表明，提取温度和乙醇浓度是影响幼果多酚得率的主要因素。梨幼果多酚提取最佳提取组合为A3B3C1D3，即乙醇浓度60%，提取温度70℃，提取时间2h，提取料液比1:30（g/mL），依照此组合进行提取试验，多酚得率可达到1.47mg/g。

3梨幼果多酚物质HPLC分析结果

利用高效液相色谱法可以较好地分离各种酚类成分，标样中11种组分的出峰顺序依次为熊果苷、没食子酸、儿茶素、绿原酸、表儿茶素、咖啡酸、香草醛、阿魏酸、芦丁、根皮苷、槲皮素（图5-A）。梨幼果样品中测定出9种酚类物质（图5-B），未检测到根皮苷和槲皮素。检测出的酚类物质中熊果苷含量最高，为总含量的74.1%；儿茶素、绿原酸、香草醛含量较高，为主要的酚类物质；没食子酸含量最低。

结论

本文对梨幼果多酚提取条件进行了优化，并利用高效液相色谱分析其组分，为梨果实酚类物质代谢研究和生物资源的利用提供了可靠的理论依据和技术方法。正交试验和方差分析结果表明提取温度、乙醇浓度对梨幼果多酚得率的影响是显著的，最佳提取工艺组合：乙醇浓度60%，提取温度70℃，提取时间2h，提取料液比1:30（g/mL），依照此水平进行提取试验，多酚得率可达到1.47mg/g。通过高效液相色谱分析可知，梨幼果主要含有熊果苷、儿茶素、绿原酸、香草醛等多酚物质，其中熊果苷含量最高，为总含量的74.1%。熊果苷能有效地抑制皮肤中的生物酪氨酸酶活性，抑制皮肤黑色素的形成，是目前国内外美白化妆品中的主要原料[14]。因此，梨幼果可作为化妆品美白剂熊果苷的天然原料，是潜在的生物资源。