2021-4-9 | 工艺论文
作者：石恩慧 郭凯军 李红 谷明灿 鲁琳 贾昌喜 单位：北京农学院食品科学与工程学院 农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室 北京农学院动物科学与技术学院
１材料与方法
１．１材料与主要试剂板栗总苞（采自北京市怀柔区板栗实验站）：用粉碎机将板栗壳粉碎并过８０目筛，－１８℃避光保存备用。主要试剂：福林－酚（ＦＣ）试剂、没食子酸标准品（含量＞９８％）和ＤＰＰＨ购于Ｓｉｇｍａ公司；ＡＢＴＳ购于东京化成工业株式会社；维生素Ｃ和维生素Ｅ购于北京奥博星生物技术有限责任公司。
１．２板栗总苞多酚提取工艺流程干燥板栗总苞粉碎溶剂与物料混合不同条件下水浴提取（每个样提取２次）混合２次提取液离心浓缩板栗总苞多酚提取液冷冻干燥提取物粉末。
１．３板栗总苞多酚提取条件的研究
１．３．１单因素试验设计称取１０ｇ板栗总苞，用乙醇浓度为６０％，液料比为２０∶１（ｍＬ∶ｇ），提取温度为６０℃，提取时间为１２０ｍｉｎ作为进行单因素筛选试验的基础条件。当研究某一因素时，其他条件保持不变。乙醇浓度分别选用２０％、３０％、４０％、５０％、６０％和７０％；液料比（ｍＬ∶ｇ）分别选用１５∶１、２０∶１、２５∶１、３０∶１和３５∶１；提取时间分别选用４０、８０、１２０、１６０和２００ｍｉｎ；提取温度分别选用５０、６０、７０、８０和９０℃，按上述设计分别进行单因素不同水平的选择试验，得到的提取物按照标准曲线处理方法，测定在７６５ｎｍ波长处的吸光度，并计算转换为板栗总苞多酚提取得率，以此比较提取效果。
１．３．２正交试验设计为了综合考虑各因素对板栗总苞多酚提取得率的影响，根据１．３．１中单因素试验结果，选取乙醇浓度、液料比、提取时间和提取温度为４个考察因素，利用ＳＰＳＳ１６．０设计四因素四水平［Ｌ１６（４４）］正交试验，试验因素水平见表１。
１．３．３板栗总苞多酚的测定
１．３．３．１没食子酸标准曲线的制作准确称取５ｍｇ没食子酸标准品于５０ｍＬ容量瓶中，定容至刻度，配成０．１ｍｇ／ｍＬ的标准液，分别吸取０．５、１．０、１．５、２．０和２．５ｍＬ没食子酸标准液（０．１ｍｇ／ｍＬ）并定容至１０ｍＬ，配制成质量浓度为０．００５、０．０１０、０．０１５、０．０２０、０．０２５ｍｇ／ｍＬ的标准溶液。精确吸取上述标准溶液０．４ｍＬ于１０ｍＬ离心管中，加入０．２ｍｏｌ／ＬＦＣ试剂１ｍＬ、１５％Ｎａ２ＣＯ３溶液２ｍＬ，蒸馏水定容至８ｍＬ，２５℃反应２ｈ。另精确吸取蒸馏水０．４ｍＬ，同法操作作为空白对照。在７６５ｎｍ波长处测量其吸光度。绘制吸光度与浓度的标准曲线（图１），并拟合线性回归方程。所得标准曲线的线性回归方程为：Ｙ＝４．３２３Ｘ＋０．０１６６（Ｒ２＝０．９９９８）。式中：Ｙ为吸光度；Ｘ为没食子酸标准品浓度（ｍｇ／ｍＬ）。标准曲线表明，没食子酸在浓度为０．００５～０．０３０ｍｇ／ｍＬ区间有良好的线性关系。
１．３．３．２板栗总苞多酚提取得率、多酚含量计算按照以下公式计算板栗总苞多酚提取得率、多酚含量：提取得率（％）＝提取物质量／原材料质量×１００；多酚含量（％）＝提取多酚质量／提取物质量×１００。
１．４板栗总苞多酚体外抗氧化试验
１．４．１样品处理板栗总苞多酚和维生素Ｃ母液的配制：分别精确称取０．５ｇ板栗总苞多酚和维生素Ｃ粉末放于烧杯中，加蒸馏水溶解，将此溶液转移到５００ｍＬ的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，配成终浓度为１ｍｇ／ｍＬ的母液；维生素Ｅ母液的配制：精确称取０．５ｇ维生素Ｅ粉末于烧杯中，加体积比为１０％的乙醇水溶液２０ｍＬ，振荡使之溶解，转移到５００ｍＬ容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，配成终浓度为１ｍｇ／ｍＬ的母液。
１．４．２ＤＰＰＨ•清除率测定参考Ｌｕｏ等［１８］的方法，同时作适当修改。取板栗总苞多酚、维生素Ｃ和维生素Ｅ母液，分别稀释成不同浓度（０．０２５、０．０５０、０．０７５、０．１００、０．１２５、０．１５０、０．１７５和０．２００ｍｇ／ｍＬ）的溶液。吸取不同浓度的板栗总苞多酚、维生素Ｃ和维生素Ｅ溶液２．０ｍＬ，加入２．０ｍＬＤＰＰＨ•溶液（０．２ｍｍｏｌ／Ｌ），摇匀，避光放置３０ｍｉｎ。以无水乙醇调零，测定５１７ｎｍ波长处的吸光度（Ａ样）；分别测定２．０ｍＬ不同浓度的板栗总苞多酚、维生素Ｃ和维生素Ｅ溶液与２．０ｍＬ无水乙醇混合液的吸光度作为对照（Ａ对照）；测定２．０ｍＬＤＰＰＨ•溶液与２．０ｍＬ无水乙醇混合液的吸光度作为空白（Ａ空白）。ＤＰＰＨ•清除率按以下公式计算：ＤＰＰＨ•清除率（％）＝（１－Ａ样－Ａ对照Ａ空白）×１００。
１．４．３ＡＢＴＳ＋•清除率测定参考Ｒｅ等［１９］的方法，同时作适当修改。取板栗总苞多酚、维生素Ｃ和维生素Ｅ母液，分别稀释成不同浓度（０．０５０、０．１００、０．１５０、０．２５０、０．３００、０．４００、０．４５０和０．５００ｍｇ／ｍＬ）的溶液。ＡＢＴＳ＋•储备液配制：配制２．４５ｍｍｏｌ／Ｌ过硫酸钾，用过硫酸钾溶解ＡＢＴＳ粉末，配成７ｍｍｏｌ／ＬＡＢＴＳ＋•储备液，避光、４℃冰箱中保存备用。ＡＢＴＳ＋•测定液配制：将ＡＢＴＳ＋•储备液以磷酸盐缓冲液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７．４）稀释，使其吸光度在７３４ｎｍ波长处达到（０．７００±０．０２０）。测定方法：取４ｍＬＡＢＴＳ＋•测定液，加入４０μＬ不同浓度的板栗总苞多酚、维生素Ｃ和维生素Ｅ溶液，振荡３０ｓ，反应１０ｍｉｎ，在７３４ｎｍ波长处测定吸光度（Ａ样）。ＡＢＴＳ＋•清除率按以下公式计算：ＡＢＴＳ＋•清除率（％）＝（１－Ａ样０．７００）×１００。
１．４．４猪油ＰＯＶ测定取板栗总苞多酚母液，分别稀释成浓度为０（对照组）、５０、１００、１５０和２００μｇ／ｍＬ的板栗总苞多酚溶液，各取４ｍＬ，分别添加到盛有４ｇ猪油的烧杯中，混匀，放于６０℃烘箱里［２０］，每个浓度做３个平行试验，分别在０、４、８、１２、１６和２０ｄ时，参考ＧＢ／Ｔ５５３８—２００５方法测定猪油中ＰＯＶ。从结果中选取板栗总苞多酚最佳浓度，然后，以同样的方法和测定时间，测定板栗总苞多酚和维生素Ｃ、维生素Ｅ在此浓度下对猪油中ＰＯＶ的影响。１．５统计分析正交试验Ｌ１６（４４）由ＳＰＳＳ１６．０软件生成，采用ＧＬＭ程序对正交试验结果进行方差分析，并确定提取工艺条件最优化组合。采用ＡＮＯＶＡ程序对板栗总苞多酚与维生素Ｃ、维生素Ｅ抗氧化性进行分析并用Ｔｕｒｋｅｙ进行多重比较。