gTME对酿酒酵母SAM代谢的影响

作者：曹喜涛 陈凯 李扬 窦洁 王慧 周长林 奚涛 单位：中国药科大学生命科学与技术学院 江苏科技大学蚕业研究所

S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)是一种广泛存在于生物体内并且具有重要生理功能的活性物质。它参与体内核酸、蛋白质、磷脂、体内激素和神经递质生物合成和代谢等40多种生物反应［6-7］。可用于治疗抑郁症［8］、关节炎［9］、肝功能紊乱等疾病［10］、阿尔兹海默病［11］，具有起效快，副作用小，安全可靠等特点。随着SAM的价值逐渐被人们所认识，市场需求量也日趋增长［12］。目前美国市场常见的SAM成品药主要为欧洲进口的硫酸对甲苯磺酸盐双盐，还有部分产品为美国产稳定性更好的聚丁基磺酸盐。而国内尽管进行了很多研究，但一直未能实现工业化生产。酿酒酵母是常见的真核生物，并且其全基因组序列已经测定完成，被美国食品与药品安全管理局(FDA)认证为安全的微生物(GRAS，Generallyrecognizedassafe)［13］。利用酿酒酵母生产SAM已有的研究主要集中在高产菌株的筛选和诱变［14-17］、发酵条件的优化［18-24］、SAM2的过表达和DNAShuffling［25-31］、CBS基因敲除［32］等，但是这些研究主要集中在单个基因的过表达或者敲除的研究，同时也未见商业化应用的报道。本文采用gTME技术，通过对RNA聚合酶II转录起始复合物的TATA结合蛋白之一的SPT15和TATA结合蛋白相关因子之一TAF25编码的基因进行易错PCR，建立突变文库，构建重组酿酒酵母菌株，研究了gTME对酿酒酵母SAM代谢的影响，为获得工业化生产菌株建立基础。

1材料与试剂

1.1质粒和菌种pMD18-TVector克隆载体购自Takara公司，质粒pFA6a-GFPS65T-kanMX6由天津大学王静宇惠赠，质粒pYES2.0由中国科学院上海生命科学研究院赵云坡博士惠赠，大肠杆菌E.coliDH5α、酿酒酵母S.cerevisiaeCGMCC2846由中国药科大学微生物教研室保存。

1.2试剂限制性内切酶EcoRI、BamHI、NheI、T4DNA连接酶、Taq酶、PCR相关试剂、质粒提取试剂盒均购自Takara公司。限制性内切酶AgeI、凝胶回收试剂盒购自Fermentas公司，氨苄青霉素钠盐、Geneticin(G418硫酸盐)购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。易错PCR试剂盒为蓝罡生物购自北京柏莱斯特科技发展有限公司。引物合成、DNA测序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。1.3培养基大肠杆菌用LB培养基培养(g/L):酵母提取物5，胰蛋白胨10，NaCl10，转化子培养时添加50μg/mL氨苄青霉素。酿酒酵母用YPD培养基培养(g/L):酵母提取物10，蛋白胨10，葡萄糖20，固体培养基加入2%琼脂粉和120μg/mLG418。筛选高产SAM菌株时采用O-medium(g/L)［33］:葡萄糖50，蛋白胨10，酵母提取物5，KH2PO44，K2HPO42，MgSO4•7H2O1.5，L-met3，pH6.0。

2方法

2.1酿酒酵母S.cerevisiaeCGMCC2846基因组的提取根据参考文献［34］采用玻璃珠破碎的方法提取酿酒酵母基因组，作为扩增SPT15和TAF25基因的模板。

2.2spt15和taf25基因的克隆及其易错PCR文库的建立本研究中所用的引物见表1。转录因子spt15和taf25采用PCR的方法，以酿酒酵母总DNA为模板，扩增出的基因经琼脂糖凝胶试剂盒回收后，与pMD18-T载体连接，转化感受态E.coliDH5α。将正确转化的E.coliDH5α由南京金斯瑞生物科技有限公司进行DNA测序。测得的基因序列登陆NCBI数据库，进行序列比对。以获得的SPT15和TAF25基因为模板，依据易错PCR试剂盒的说明进行易错PCR，构建转录因子spt15和taf25的易错PCR文库。

2.3重组酿酒酵母表达载体pYES-KanMX的构建和重组酿酒酵母筛选根据质粒pYES2.0酶切位点的特性，选择G418基因的插入位点。引物Kan-F/Kan-R用于扩增G418基因，在正向引物中引入NheI的酶切位点，反向引物中引入NdeI的酶切位点。以质粒pFA6a-GFPS65T-KanMX6为模板，PCR扩增G418抗性标记基因，扩增产物连接到pMD18-T载体，构建pMD18-KanMX。然后分别对pMD18-KanMX和pYES2.0进行NdeI/NheI双酶切，凝胶回收基因片段并用T4连接酶连接。构建表达载体pYES-KanMX质粒，使pYES2.0的营养缺陷标记改变为G418抗性标记。将spt15和taf25易错PCR的片段经相应的限制性内切酶酶切，用T4连接酶连接经同样限制性内切酶处理的表达载体pYES-KanMX，并转化感受态的大肠杆菌DH5α，构建表达载体的易错PCR文库。提取转录因子spt15和taf25易错PCR表达载体突变文库的质粒，并用醋酸锂的方法转化感受态的酿酒酵母S.cerevisiaeCGMCC2846，以含120μg/mLG418的YPD培养基上，28℃培养2～3d。将单菌落影印到新的含有120μg/mL的G418的YPD平板上。28℃培养3～5d。将pYES-KanMX空载体转化酿酒酵母菌株，获得酵母对照菌株。

2.4转录因子spt15和taf25突变基因转化子的筛选和发酵性能研究将YPD-G418平板上生长的酵母菌落保存于YPD斜面培养基上，分别接种于O-medium，200r/min，28℃条件下培养48h后用HPLC的方法测定SAM含量。将获得SAM产量高于对照的阳性重组子，按2%的接种量接种于500mL锥形瓶(内有100mLO-mediun培养基)，控制起始的OD值一致，30℃、200r/min条件下培养。定时测定菌体OD600，绘制生长曲线，并测定发酵液中SAM的产量。SAM测定采用HPLC的方法，具体是1.0mL发酵液与2.0mL1.5mol/L高氯酸混匀，40℃反应0.5h，8000g离心10min，取上清过0.45μm备用。SAM含量用HPLC测定，色谱条件:江苏汉邦C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，检测波长254nm;流动相:0.1mol/L甲酸铵;体积流量:1.0mL/min;柱温:40℃;进样体积:10μL。2.5突变体的遗传稳定性研究突变体在YPD斜面传代，每48h转接一次，共传代5次，将传代后的菌种进行生长和发酵试验，并与原代的菌株进行比较，研究其SAM产量的传代稳定性。

3结果

3.1spt15和taf25基因的克隆以S.cerevisiaeCGMCC2846的基因组DNA为模板，利用设计的引物进行PCR扩增，得到的PCR产物电泳检测在0.75kb左右(图1)。将PCR产物经纯化后和克隆载体pMD18-T连接，连接产物转化感受态的大肠杆菌DH5α，提取转化子质粒，将阳性克隆进行基因序列测定，测序结果登陆NCBI数据库进行序列比对，结果表明得到的SPT15和TAF25基因的序列与数据库中的基因序列同源性100%。

3.2spt15和taf25基因易错PCR文库的建立利用易错PCR试剂盒以质粒pMD18-SPT15和pMD18-TAF25为模板进行易错PCR，经琼脂糖电泳检测易错PCR产物与PCR产物基本相同(图2)。将spt15和taf25易错PCR的扩增片段经琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后用于构建表达载体的易错PCR文库。