白藜芦醇的定量分析

作者：唐迪 赵婷 仰榴青 单位：江苏农林职业技术学院 江苏大学食品与生物工程学院 江苏大学化学化工学院

酿酒葡萄渣由河北和新疆提供;白藜芦醇标准品(中国药品生物制品检定所生产);甲醇为上海化学试剂有限公司生产，色谱纯;其他试剂均为市售分析纯。料处理酿酒葡萄渣在60℃的电热恒温鼓风干燥箱中烘24h，粉碎后过40目筛，置干燥器中备用。白藜芦醇的提取［13－15］精密称取30g酿酒葡萄渣原料，以80%乙醇作为提取溶剂，液料比为10mL∶1g，提取温度为60℃，共提取3次，每次提取时间为2h，第2、3次提取前各超声10min，合并3次所得滤液，在40℃条件下用旋转蒸发仪浓缩至干，用三氯甲烷－丙酮－乙醇－水(体积比4∶4∶0．5∶0．2)溶解，置于10mL容量瓶中，定容得酿酒葡萄渣提取样品。

样品预净化处理(1)白藜芦醇的定性鉴定。白藜芦醇在365nm处显蓝紫色荧光。用薄层层析法检测，展开剂为三氯甲烷－丙酮－乙醇－水(体积比4∶4∶0．5∶0．2)时，根据标准品Rf值=0．638定性鉴定白藜芦醇的存在，从而能有效控制预处理过程。点样:取活化好的硅胶GF254板，薄层板尺寸为:10cm×20cm，距薄板一端约1．5cm处，用铅笔轻轻划1条与底边平行的直线，确定各样品点样位置。然后分别用毛细管吸取白藜芦醇标准溶液、酿酒葡萄渣溶液进行点样。样点之间的距离约1cm，薄层两边距离约1cm。展开:将点样好的薄层板置于展开剂中，上行展开15cm，取出，挥干溶剂。检测:在365nm紫外灯下观察荧光斑点。(2)样品预净化处理。准确吸取0．5mL提取样品，加样于硅胶柱上(硅胶10g，硅胶柱为10mm×250mm的玻璃柱，湿法装柱)。用约35mL三氯甲烷－丙酮－乙醇－水(体积比4∶4∶0．5∶0．2)洗脱，依据上述方法跟踪鉴定，收集白藜芦醇组分，浓缩至干。用甲醇溶解，置于10mL容量瓶中定容，用0．45μm滤膜过滤得样品溶液。平行处理3个样品，待HPLC测定。1．3．4白藜芦醇含量测定(1)检测波长的选择。以甲醇作为溶剂空白，在220～400nm处对白藜芦醇标准品溶液进行扫描，确定白藜芦醇的最大吸收波长。(2)HPLC色谱分析条件。色谱条件:色谱柱HypersilODS(4．6mm×250mm，5μm);流动相－甲醇－水(体积比45∶55);流速0．8mL/min;柱温35℃;检测波长:306nm;色谱工作站:ShimadzuClass－VP。(3)外标曲线的测定。准确称取白藜芦醇标准品，用甲醇－水(体积比50∶50)溶解后，置于25mL容量瓶中定容。分别从中吸取1、2、3、4、5mL用50%甲醇分别定容至10mL，用0．45μm滤膜过滤，得浓度分别为1．65、3．3、4．95、6．6、8.25μg/mL的白藜芦醇标准溶液。在上述色谱条件下进样10μL，平行测定3次，求其峰面积的平均值，计算得外标曲线。(4)酿酒葡萄渣中白藜芦醇含量测定。将“1．3．3”预净化处理过的样品进样20μL，平行测定3次，计算白藜芦醇的峰面积，根据外标曲线求出白藜芦醇的含量。

检测波长的选择白藜芦醇的紫外吸收光谱图见图1。可见最大吸收波长为306nm，与前人研究结果一致，故本研究选择306nm为检测波长。

外标曲线的确定白藜芦醇标准品的HPLC图见图2。以对照品进样量(μg)x对峰面积积分值y进行线性回归，结果表明，白藜芦醇在0．0165～0．0825μg范围内线性关系良好，其线性方程为y=7×106x－82231(r=0．9999)。

重现性试验按“1．3．4”(4)方法处理样品，平行5份，测定白藜芦醇的峰面积，其5次测定的RSD为4．8%，重现性好。

稳定性试验按“1．3．4”(4)方法处理样品，精密吸取同一样品溶液，于0、1、2、3、4、5、6、12、24h分别进样测定峰面积，RSD为1.2%(n=9)，可见样品在24h内基本稳定。

加样回收率试验加20μg白藜芦醇标准品于酿酒葡萄渣样品中，平行5份，按“1．3．4”(4)方法处理样品并进行HPLC测定，每个样品平行测定3次，求平均峰面积，根据外标曲线计算加样回收率。5次测定的白藜芦醇的回收率为94．1%、95．3%、96.7%、102．9%和105．6%，平均回收率为98．9%，RSD为5.04%(n=5)。

酿酒葡萄渣中白藜芦醇的含量测定酿酒葡萄渣预处理样品的HPLC图谱见图3。经过一步硅胶柱预处理，不仅白藜芦醇得到了富集，且白藜芦醇峰与其他杂质峰得以完全分离，无杂质峰干扰，预处理净化效果好。试验测得河北酿酒葡萄渣中白藜芦醇的含量为6．482μg/g干葡萄渣，而新疆酿酒葡萄渣中未检测到白藜芦醇。

采用一步硅胶柱预处理方法可用于酿酒葡萄渣中白藜芦醇含量的HPLC测定，线性回归方程为y=7×106x－82231(r=0．9999)，线性范围为0．0165～0．0825μg，精密度和重现性好，平均加样回收率为98．9%，RSD为5．04%(n=5)。测得河北酿酒葡萄渣提取物预处理样品中白藜芦醇的含量为6．482μg/g，新疆酿酒葡萄渣中白藜芦醇的含量甚微，HPLC无法检测。HPLC方法简便，快速，可用于白藜芦醇的定量分析。

由于葡萄渣中白藜芦醇的含量少，酿酒葡萄渣提取物用硅胶柱预处理效果好，可有效去除影响色谱柱使用寿命的脂溶性杂质，也使白藜芦醇得到了富集，能进行HPLC测定。结果表明，不同产地的酿酒葡萄渣中白藜芦醇的含量不同，可能与酿酒工艺及葡萄的品种有关;酿酒后的葡萄渣中白藜芦醇的含量低于相关资料的鲜食葡萄皮中的含量，与葡萄酒中白藜芦醇的含量较高相吻合。