生物医学在体成像技术作用

本文作者：兰海云 汪爱勤 尹文 单位：第四军医大学基础医学部 第四军医大学基础医学部 第四军医大学中心实验室

在体成像技术的发展及成像策略的不断提高，能够在活的生物体内揭示细胞和分子水平的诸多细微变化，有助于在生物整体、真实的体内环境中高时间分辨率地研究生命过程。针对某一生物过程的带有光学标记的报告基因已被广泛应用于细胞生物学的研究，近年来正被更多地用于在活的动物模型中探究人体内生理机能和疾病的生物学过程。利用荧光蛋白、萤光素酶基因等生物材料标记细胞、病原体和基因，早已被证实是一种在体内设置“检测器”、体外直观检测的非常可行的策略[1]。

1在体生物发光成像技术的原理

通过生物技术将构建的以萤光素酶基因作为标记基因的载体（重组原核表达质粒、重组真核表达质粒或重组病毒），经转化、转染或感染并筛选得到重组病原菌、细胞（如免疫细胞、肿瘤细胞、胚胎干细胞等）或重组病毒（如腺病毒、慢病毒、逆转录病毒等）用于转入小动物；或是将含萤光素酶及调控序列的载体线性化后经显微注射等技术稳定整合于小动物基因组制备转基因动物[2－4]。标记基因的表达可通过多种调控元件进行调控，如靶基因的启动子和增强子等；标记的方法因研究领域、研究目的和实验策略的不同而各异[4]，但最终都是在体内组织如血液、肝脏、脑、脾、肾等靶部位因特定生物过程的发生而伴随产生有酶活性的萤光素酶。在注入底物即萤光素的条件下，萤光素酶催化底物反应产生特定波长的光信号，通过成像系统可以直观检测到光信号的产生及变化，实时反映体内发生的生物过程，如基因的调控表达、信号传导、蛋白质之间的相互作用、细胞增殖与分化等。因此，在体生物发光成像技术可广泛应用于分子生物学、细胞生物学、病毒学与免疫学、肿瘤学等研究领域[5－8]。

2在体生物发光成像技术的应用

2．1标记于肿瘤细胞、免疫细胞、胚胎干细胞等，转入体内后进行成像

萤光素酶基因作为一种报告基因，最初应用于体外培养细胞内目的基因的表达研究。在体生物发光成像技术的发展，使其能够应用于在体组织细胞的表达研究[9]。萤光素酶是一类生物发光酶，1种细胞可同时被2种具有不同底物的萤光素酶标记。例如其一可由一组成性稳定表达的启动子驱动，作为内参，反应细胞数量的变化；另一萤光素酶由要研究的组织特异性启动子驱动，其发光信号的变化，在消除细胞数量变化的影响后就可反映特定的启动子在动物体内的表达活性[10－11]。

2．1．1肿瘤及抗肿瘤研究在体生物发光成像技术可直接实时地监测各种癌症模型中肿瘤的生长和转移，并可对癌症治疗中癌细胞的变化进行实时观测和评估，能够无创伤地定量检测小鼠整体的原位瘤、转移瘤及自发瘤。Klerk等[12]研究证实了利用此技术测量肿瘤负荷具有很高的可靠性。Minn等[13]应用该技术进行了乳腺癌肺转移相关基因的研究，他们构建能够表达荧光蛋白、萤光素酶的反转录病毒载体，并稳定转染已获得的不同亚群肿瘤细胞，先通过荧光激活细胞分选术筛选同一亚群内具有相同转染效果（稳定表达外源蛋白即荧光蛋白和萤光素酶，且水平一致）的细胞，并尾静脉注射免疫缺陷小鼠，通过检测生物发光的部位和大小，评价不同亚群肿瘤细胞向肺部位的转移情况及其转移能力，再通过检测细胞内各基因的表达差异来分析肺转移相关基因。Gupta等[15－16]又用相似的方法来研究乳腺癌脑转移相关基因及乳腺癌肺转移过程中分化基因介导的肿瘤再起始，结果再次显示了生物发光成像技术应用于肿瘤及癌转移机理研究领域的优越性。

2．1．2抗肿瘤免疫及肿瘤细胞疫苗的研究用带有生物发光标记基因的小鼠淋巴细胞或基因修饰的肿瘤细胞疫苗，可以检测放射及化学药物治疗的效果，并可寻找在肿瘤骨髓转移及抗肿瘤免疫治疗中复杂的细胞机制。Cayeux等[17]用萤光素酶基因标记基因修饰的肿瘤细胞疫苗来免疫小鼠，而用另一种底物不同于前者的5，6－carboxy－succinimidyl－fluorescein标记该小鼠内一种与肿瘤相关的免疫细胞，通过2种不同的标记研究了基因修饰的肿瘤细胞疫苗免疫小鼠后抗原递呈、免疫细胞之间的相互作用及不同免疫细胞在体内免疫过程中的作用。

2．1．3药物促肿瘤细胞凋亡的研究当萤光素酶与抑制多肽以融合蛋白形式在哺乳动物细胞中表达，产生的融合蛋白无萤光素酶活性，细胞不能发光，而当细胞发生凋亡时，活化的caspase－3在特异识别位点切去抑制多肽，萤光素酶活性得到恢复，由此可用于观察活体动物体内的细胞凋亡相关事件。细胞凋亡时被激活的caspase－3／7与DEVD－氨基萤光素（aminoluciferin）特异结合而被酶解为氨基萤光素，它可被萤光素酶识别而产生生物发光信号。Liu、Hickson等[18－19]利用这一现象设计的细胞凋亡检测方法均能够以极低的DEVD－氨基萤光素量获得较强的发光强度，因而这一方法可用于评价TNFα（α肿瘤坏死因子）、FasL、TRAIL（TNF相关促凋亡配体）等因素针对肿瘤的治疗效果。

2．1．4胚胎干细胞及再生医学的研究胚胎干细胞在再生医学领域极具应用前景，然而注入活机体的胚胎干细胞及其分化细胞尚存在显著的细胞死亡、畸胎瘤的形成、宿主免疫排斥反应等障碍。应用在体生物发光成像技术，可对胚胎干细胞本身及其在注入机体后的存活、增殖、分化等生物事件的发生机理进行深入研究，从而使上述诸多问题得以解决[20]。

2．2标记病原微生物，用于研究感染致病机制、转移途径及宿主免疫反应等

在感染性疾病的研究中，在体生物发光成像技术的应用，不仅可以提供疾病进程中观测病原体在动物体内的寄居部位、数量变化及对外界因素的反应等实时变化信息，而且更有助于揭示感染体内病原体逃逸宿主防御的机制[21]。对病原体感染过程非侵入性的检测能够对疾病进程实时地提供新的信息，且有可能发现新的感染位点[22]。Lucker等[23－26］以萤光素酶基因标记HSV－1（单纯疱疹病毒）并分别侵染Ⅰ类干扰素受体缺失、Ⅱ类干扰素受体缺失、Ⅰ和Ⅱ类干扰素受体均缺失的小鼠，可观察到HSV－1对不同干扰素受体缺失小鼠的肝脏、肺、脾、淋巴结的侵袭，及病毒从血液系统进入神经系统的过程，从而证实了不同干扰素在HSV－1感染中所起的不同的作用。Lucker等[27]针对痘苗病毒的类似研究也证实，不同干扰素在机体感染过程中各自和协同发挥的重要作用。