2021-4-9 | 生物医学论文
本文作者：张路遥 牛婉婷 杨昊 潘敏 单位：浙江大学生物医学工程
量子点(quantumdots,QDs)是一种荧光半导体纳米晶体,直径1~100nm。量子点主要由Ⅱ~Ⅵ族元素(如CdSe、CdTe、CdS、ZnSe等)或Ⅲ~Ⅳ族元素(如InP、InAs等)组成,目前生物医学领域研究常用的水溶性量子点主要是CdX(X=S、Se、Te)[1]。由于量子限域效应量子点具有独特的光学特性:耐光漂白、激发光谱宽、发射光谱窄且随粒径大小的改变而改变。所以,不同粒径的量子点可以在同一激发光的激发下发射不同颜色的荧光,有望解决传统染料在复色检测中存在的光谱覆盖、不能同时激发等问题。1996年,Alivisatos[2]解决了量子点作为生物探针与生物分子之间的相容性问题,实现了量子点在生物领域的应用。1998年,Chan等[3]实验证明量子点作为荧光标记物有传统荧光染料20倍的亮度、100倍的抗光漂白能力、1/3的发射半峰宽,从此,量子点成了最有前途的荧光标记物之一。经过修饰的水溶性量子点,表面可与多种生物分子结合,从而获得功能基团;基于量子点的探针和检测系统可广泛应用于生物医学检测系统中;量子点的表面敏感特性在检验中也得到了应用[4,5];在荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)技术中量子点作为供体也显示了传统荧光染料所没有的优点;量子点在各种新技术中的应用更显示了其巨大的潜力。本文将全面综述经过修饰的量子点在各方面的应用现状。
1量子点探针的应用
经过修饰的水溶性量子点具有免疫活性[3]和高度的特异性[6],可以作为荧光探针应用于荧光免疫分析。偶联了抗体的量子点探针可用于检测抗原或细菌、肿瘤等有表面抗原的病原体、细胞、组织,并且具有很高的灵敏度。另外,量子点对表面变化非常敏感,基于量子点的这一特性发展起来的荧光猝灭探针、酶活性探针也具有很好的实用价值。
1.1量子点荧光免疫探针用于抗原检测
Azzazy等[7]用亲和素量子点探针对生物素化的前列腺特异性抗原(prostatespecificantigen,PSA)进行了检测,检测限低达0.38pg/ml。Ker-man等[8]改进了探针制备技术,将量子点与单克隆抗体通过亲和素-生物素偶联制成探针,从而可以利用双抗夹心免疫法直接对人血清标本中的PSA进行检测,其检测限可达0.25ng/ml,线性范围为0•25~100ng/ml。
1.2量子点荧光免疫探针用于细菌检测
Hahn等[9]报道了一种用量子点免疫探针检测大肠杆菌O157∶H7的检测技术。他们用链霉亲和素修饰的CdSe/ZnS核壳式量子点和生物素化的抗体偶联,这种探针可以特异性地识别大肠杆菌O157∶H7,检测限达2•08×107cfu/ml,比传统异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)灵敏度更高、稳定性更好。Yang等[10]利用不同颜色的量子点同时检测了两种病原菌:大肠杆菌O157∶H7和伤寒沙门氏菌S.Typhimurium。发射波长分别为525nm和705nm的两种量子点分别偶联大肠杆菌O157∶H7和伤寒沙门氏菌S.Typhimurium的抗体。该方法能特异性识别并定量检测混合体中相应的细菌,检测限为1×104cfu/ml。
1.3量子点荧光免疫探针用于肿瘤检测
Hu等[11]用PEG修饰的CdSe量子点实现了细胞表面肿瘤标记物-癌胚抗原(carcinoembryonican-tigen,CEA)的检测。PEG量子点通过静电吸附偶联CEA抗体rch24。这种探针能比传统的FITC标记更有效地检测LS180细胞系表面表达的CEA。Yu等[12]用CdSe/ZnS量子点偶联鼠抗人甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)抗体来识别肝癌标记物AFP,量子点-AFP抗体探针通过尾静脉注射到小鼠内。点对点激光照射获取肿瘤部位和正常组织的荧光信号:荧光主要分布在肝癌组织上,周围组织的荧光强度迅速下降,基本无非特异性分布。
1.4量子点荧光探针猝灭的应用
量子点表面修饰有生物活性的酶之后,基于量子点对表面敏感的特性,可以用于检测酶底物的浓度。Ji等[13]报道了一种新颖的基于CdSe/ZnS量子点-有机磷水解酶(organophosphorushydrolase,OPH)探针的生物传感器。其荧光猝灭程度和有机磷的浓度成线性相关,检测限可达10-8mol/L。增大OPH和量子点的比例能够增加传感器的灵敏度,但是当量子点表面结合的OPH已经饱和后,探针灵敏度不再增加。该方法为有机磷的检测提供了新途径,极具实用价值。
2量子点FRET在检测中的应用
FRET是一项应用能量转移来测量分子级别的距离的技术。当供体发射的荧光与受体的吸收光谱重叠,并且供受体之间的距离很近(<10nm)时,供体受激发产生的偶极子震荡就会引起受体偶极子的共振,发生这种非放射性的能量转移[14]。FRET对供受体间的距离非常敏感[15],可以用来检测蛋白质、核酸的分子结构和距离的微小变化。量子点作为FRET供体相对于有机荧光染料在灵敏度方面有很大的优势:量子点的激发光谱宽,可以选择产生背景荧光少的激发波长段来进行检测,量子点-有机染料-FRET探针可产生相对背景荧光更显著的荧光信号,从而能够检测到较低浓度的目标,并且多余的探针并不影响检测效果,操作起来更为方便。
2.1量子点FRET在DNA检测中的应用
基于量子点检测DNA的方法很多,大部分量子点DNA探针是用量子点作为供体、有机染料作为受体的。Zhang等[16]介绍了一种超灵敏的、基于量子点荧光共振转移的DNA检测方法。该方法可以用于检测未分离的低浓度DNA。量子点修饰一段DNA单链,有机染料Cy5标记另一段DNA单链,Cy5作为受体,量子点作为供体,二者与目标DNA结合,从而发生FRET。与同样用FRET技术的分子信标法相比,量子点作为供体背景荧光更少,灵敏度更高(4•8fmol/L),目前已成功检测基因点突变。
2.2量子点FRET在蛋白浓度和酶活性检测中的应用
Ma等[17]发现FRET可以用于检测溶液中鼠源IgG的含量。红绿两种不同颜色的量子点先后加入到IgG溶液中与IgG通过静电结合后可以观测到FRET现象的发生。FRET增强的程度和IgG浓度成线性相关,线性范围在0•1~20•0mg/L。在此FRET体系中加入木瓜蛋白酶后,IgG酶解,两种量子点之间的距离增大,FRET也随之消失。从另一个角度考虑,FRET也可以用于酶的活性检测。基于这一原理,Xu等[18]将Cy5-底物-量子点FRET探针用于β-内酰胺酶的活性的检验,检测限32μg/ml。这种酶是细菌产生的,其活性与细菌的抗药性相关,在检验β-内酰胺类抗生素药效方面具有很重要的临床意义。
3量子点在新技术中的应用