2021-4-9 | 生物医学论文
本文作者：闫琳 王晓英 郭云昌 单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所
PCR-ELISA是利用了PCR技术的高敏感性、核酸探针的特异性、酶标仪直接读取结果的客观性等优点建立的一项技术。PCR-ELISA只需要具备PCR仪和酶标仪即可实施，且其灵敏度及特异性均较高，下面就PCR–ELISA技术及其在国内外生物医学领域中的应用进行介绍。
1PCR-ELISA技术
聚合酶链反应(PCR)技术自诞生以来，在各个领域都得到了广泛的应用。传统对扩增产物检测的方法主要是凝胶电泳EB荧光显色法，以定性检测为主，只能粗略的相对定量，灵敏度低，易产生假阴性和假阳性结果，另外EB还具有致癌性。NIEMEYER等创建了应用固相捕获的PCR定量技术，即在PCR扩增以后借用酶联免疫吸附试验的原理，使用酶标抗体，通过杂固相或液相杂交来实现定量检测［1］，被称为PCR-ELISA，它弥补了传统PCR检测方法的不足。该检测技术主要包括三个部分，分别为聚合酶链式反应(PCR)、扩增产物与探针的杂交及常规ELISA酶标显色［2］。通常PCR-ELISA技术需要借助生物素-链酶亲和素系统［3］。最初的PCR-ELISA采用夹心杂交法，包括捕获探针，扩增产物和检测探针，后经过改进，在PCR过程中给目的片段掺入标记物，使扩增的产物也具有检测探针的功效，即为直接杂交法。常规的PCR-ELISA只能作为一种定性试验，但若加入内标，做出标准曲线，也可达到定量检测的目的。
2在生物医学领域中的应用
2.1致病菌检测
PCR-ELISA用于致病菌的检测，通过PCR扩增、杂交及酶显色放大，使得该方法具有高的敏感性和特异性，而且应用96孔微孔板，可以同时检测多份样本，保证了检测的时效性和准确性，适于大量样本的筛选。国外对PCR-ELISA技术应用于致病菌的研究开展的较早，国内这方面的报道较少。在食物样本检测方面，PERELL等用PCR-ELISA法，检测205份鲜奶样本和300份牛肉馅样本中可编码志贺毒素的大肠埃希菌(STEC)，检出率分别为21%和15%，结果表明，PCR-ELISA对食品原料中STEC高致病性血清群的快速检测有助于STEC食物中毒的危险性评估［4］。HONG等用PCR-ELISA检测禽肉中大肠弯曲菌，空肠弯曲菌和肠炎沙门菌，针对弯曲菌的ceuE基因和沙门菌的invA基因设计特异性探针，PCR扩增后用ELISA进行检测，比传统的电泳检测法敏感性提高了100～1000倍，最低可以检测到40CFU/ml弯曲菌和200CFU/ml沙门菌［5］。作者认为PCR-ELISA是一种快速高效的用于禽肉中沙门菌和弯曲菌检测和计数的方法。2009年，曹玮等建立了检测单核细胞增生李斯特菌hlyA基因的PCR-ELISA方法，并通过人工染菌牛奶样本，对其进行验证。结果证明该方法和细菌学上传统培养法的检出符合率为100%。经过12h前增菌，PCR-ELISA的检出限为1cfu/25ml牛奶样本，比电泳法敏感10～100倍，具有良好的敏感性，特异性和可靠性，认为这种方法将有助于提高食源性疾病的预警预报能力，增强检测方法的准确性［6］。在环境样本检测方面，KUO等以大肠菌群特异的16srRNA为探针，用PCR-ELISA法检测水样中的典型大肠菌群，检测时限4h，误差率为1.4%，总大肠菌群的检出限为5cfu/100ml水样［7］。对比研究显示PCR-ELISA法不论在时间，检出限和准确度上都优于目前的传统方法。Soheili采用PCR-ELISA方法检测工业冷凝水中的嗜肺军团菌，以16srRNA为目的片段，选用特异性引物进行巢氏PCR，带有DIG标记的PCR产物和生物素标记的探针杂交，通过POD标记的抗DIG抗体在显色反应中检测扩增产物。实验共检测了5份冷凝水样本，所有样本培养法和PCR-ELISA都检出阳性，与细菌培养方法相比，PCR－ELISA特异性更高，检测速度更快，作者认为该方法适用于工业冷凝水嗜肺军团菌污染的常规检测［8］。在致病菌临床样本检测方面，YAM等用单管生物素化的巢氏PCR-ELISA法，共检测659例结核杆菌的H37RvDNA，敏感性为97%，特异性为100%。对H37RvDNA进行系列稀释，当A405=0.6时，该方法的检出限为0.75cfu/每反应。结果表明PCR-ELISA是一种敏感性高、成本低廉的分子诊断方法，适用于结核病发病率高的发展中国家的临床诊断［9］。MOUSAVI等通过PCR扩增获得编码霍乱毒素B亚基的基因，采用PCR-ELISA法快速筛查伊朗南部产毒的霍乱弧菌O1菌株。结果表明，该方法具有较好的特异性和敏感性。检测限为0.5pg基因组DNA/每反应，即相当于5个菌细胞/每反应。实验证明PCR－ELISA检测霍乱弧菌O1菌株毒素基因更加快速和简便［10］。
2.2转基因食品检测
目前国外已经开发出用于检测转基因食品的PCR-ELISA试剂盒，我国也已建立了转基因食品(如大豆，水稻，鱼)的PCR-ELISA检测法。雷勃钧等用PCR-ELISA法对大豆品种进行了转基因的定性检测，灵敏度高达0.1%［11］，足以达到欧盟1%检测阈值的要求。欧盟利用PCR技术对转基因玉米和大豆的35S启动子和NOS终止子进行水平测试时，检测灵敏度达到1%［12］，而利用PCR-ELISA法对转基因大豆的检比欧盟推荐PCR方法提高5～10倍。陈茹等先针对转基因鱼中mMT启动子和hGH基因建立了Dig－PCR-ELISA方法，5μlPCR产物经1000倍稀释仍可以检测出，与常规PCR－电泳检测方法相比敏感性可提高至100～1000倍［13］。后来又针对转基因水稻中普遍存在的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子和胭脂碱合成酶NOS终止子(Tnos)，建立了Dig–PCR-ELISA检测方法，可检测含量仅为0.1%的转基因样品，实现了半定量检测［14］。LAETITIA等以35S启动子或Bt176特异结合序列为目的片段的PCR-ELISA法筛选和检测面粉和淀粉类食物中的转基因Bt176玉米。结果表明这种方法是非常特异的，其敏感度和southern杂交相当，至少是凝胶电泳的6倍。用它来检测Bt176、Bt11、Mon810转基因玉米和抗草甘膦转基因大豆，灵敏度可以达到0.1%。作者认为PCR-ELISA是筛选鉴定面粉和天然淀粉中转基因Bt76玉米的一种可选方法，比起实时PCR更加便宜，在实验室监测中是非常有用的［15］。综上所述，在不同的转基因食品中用PCR-ELISA法，检测的灵敏度都达到了0.1%，远远超过了凝胶电泳法，超越倍数最高可达1000倍。
2.3病毒检测
目前国内外应用PCR-ELISA技术检测的病毒主要有肝炎病毒、肠病毒及禽流感病毒等。李稻等采用液相杂交技术，简化核酸杂交过程，建立乙肝病毒(HBV)PCR-ELISA方法，检测灵敏度达1×104拷贝/ml，大三阳标本的检出率为97.1%，小三阳标本的检出率为67.7%。故作者认为使用该技术可使实验操作简便、快速，适合临床实验室应用［16］。2006年，CHAHARAEIN等建立RT－PCR-ELISA法检测禽流感病毒亚型H9N2。对H9N2接种鸡的导管拭子样本连续稀释，用PCR-ELISA和传统的病毒细胞培养分离法分别进行检测，结果表明两者的检出限相似，并且PCR-ELISA法比PCR凝胶电泳法敏感性至少高10倍，因此作者认为该方法可用于检测鸡群中A型流感病毒，特别是H9N2亚型［17］。