2021-4-9 | 卫生检验论文
作者：叶文 杨柳青 张如胜 欧新华 宋克云 单位：长沙市疾病预防控制中心微生物检验科
沙门菌属是引起细菌性食物中毒的重要病原体之一,目前全世界已分离出2523个血清型,我国已发现216个[1]。快速敏感的检测方法对沙门菌食品卫生检测来说至关重要。传统检测沙门菌的分离培养方法烦琐费时;免疫学方法敏感度有待提高;各种聚合酶链反应(PCR)方法具有敏感、特异的优点[2-5],但由于需要特殊的仪器设备而限制了其在基层单位的应用。环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalam-plification,LAMP)技术[6,7]是一种新型等温核酸扩增方法,针对靶基因设计4~6条引物,利用一种具有链置换活性的BstDNA聚合酶,在恒温条件(60~65℃)保温约60min,即可完成核酸扩增反应,产物为针对靶基因扩增产生的各种大小的茎环状DNA混合物,副产物为肉眼可见的白色焦磷酸镁沉淀。目前已有多篇针对沙门菌的LAMP检测研究报道[8,9],这些研究多侧重于检测方法的建立,大多和核酸检测方法,如PCR方法进行对照研究,而且用于实际样品检测研究也较少。为此,本文利用文献报道的沙门菌属LAMP检测方法[8]对135份食品标本进行LAMP检测,同时和分离培养法检测结果进行比较来评价沙门菌属LAMP检测方法在食品卫生检测中的实际应用价值,现将研究结果报告如下。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1仪器与试剂DYY-6C型电泳仪(北京六一仪器厂);凝胶成像仪(美国BIO-RAD公司);DK-8D电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司);全自动微生物鉴定系统(美国BD公司);BstDNA聚合酶(北京纽英伦生物技术有限公司);Betaine、Mg-SO4(美国Sigma-Aldrich公司);SYBRGreenInu-cleicacidgelstain、SYBRSafeDNAGelStain(美国invitrogen);dNTP(北京天根公司);通用型核酸提取试剂盒(广州华瑞安生物);缓冲蛋白胨水(BPW)、四硫磺酸钠煌绿(TTB)、亚硒酸盐胱氨酸(SC)、亚硫酸铋琼脂(BS)、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂(XLD)、三糖铁琼脂(TSI)、赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板(广州环凯微生物科技有限公司)。
1.1.2标本来源2010年7月~10月收集的食品标本135份(冷冻生肉:16份;生鲜肉:20份;熟肉制品:21份;即食非发酵豆制品:17份;速冻米面制品:16份;冰激凌:10份;生水产品:18份;沙拉:6份;鲜榨果汁:7份;生食类蔬菜:4份),见表1。阳性控制菌株为肠炎沙门菌。
1.2方法
1.2.1食品样品的前增菌参照《食品微生物学检验沙门氏菌检验》[10]标准将收集的食品标本分别取25g,加入到225mlBPW的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1~2min后37℃培养8~18h,如为冷冻产品,应在45℃以下不超过15min解冻。
1.2.2LAMP检测食品中的沙门菌分别取1ml食品标本前增菌液10000r/min离心2min,弃其上清液后,利用核酸通用提取试剂盒进行核酸提取,再取1μl上清液做待检模板DNA。利用文献[2,10]报道的LAMP检测方法及引物对135份食品标本增菌液DNA进行检测,反应体系(25μl):FIP、BIP(40μM)各1.0μl,F3、B3(10μM)各0.5μl,10×BstDNA聚合酶Buffer2.5μl,dNTPMixture(10mM)3.5μl,Betaine(5M)5.0μl,Mg-SO4(250mM)0.6μl,BstDNA聚合酶(8U/μl)1.0μl,DNA模板2μl,加ddH2O至25μl。轻弹混匀后于水箱内65℃孵育60min,80℃2min灭活酶结束LAMP反应。LAMP反应结束后可直接进行肉眼检测:检测管出现明显浑浊为阳性,未见浑浊为阴性;也可将LAMP产物加荧光染料(1000×SYBRGreenI)2μl,1~5min观察结果,反应液变绿为阳性,保持无色或棕色为阴性。电泳鉴定:1μl扩增产物与0.2μl上样缓冲液混匀后点样于含适量SYBRSafeDNAGelStain的2%琼脂糖凝胶中,70V电泳约60~100min,电泳图片显示为最小片段>100bp的LAMP特征性梯状条带,结果为阳性;如无任何条带则结果为阴性;如见最小片段<100bp的梯状条带,则判断为非特异性扩增,需要重新检测。
1.2.3食品中沙门菌的分离培养鉴定参照《食品微生物学检验沙门氏菌检验》[10]标准分别将135份培养过的食品标本前增菌液轻轻摇动后取1ml,转种于10mlTTB增菌液内,于42℃培养18~24h。另取1ml,转种于10mlSC增菌液内,于37℃培养18~24h;分别取食品标本的增菌液1环,划线接种于一个BS平板和一个XLD平板,于37℃培养18~24h;挑取3个可疑菌落,接种TSI、赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板,于37℃培养18~24h。如果生化反应初步符合沙门菌特征,从营养琼脂平板上挑取可疑菌落,用生理盐水制备成浊度适当菌悬液,使用全自动微生物鉴定系统进行分析,必要时做血清学分型。若BS平板和XLD平板上都无可疑菌落,将BS平板于37℃继续培养18~24h,仍无可疑菌落可确定为沙门菌阴性。
1.3统计分析
利用SPSS13.0软件对数据进行统计分析。分析方法为配对设计的χ2检验。α=0.05为检验水准。
2结果
2.1沙门菌LAMP检测和分离培养结果135份食品标本增菌液经LAMP检测出沙门菌属阳性标本14份,阳性率为10.4%;经分离培养法分离出沙门菌阳性菌株6份,阳性率为4.4%,见表1。电泳检测结果,凝胶琼脂糖电泳出现最小片段>100bp的LAMP特征性梯状条带为阳性,见图1。
2.2两种方法检测结果LAMP法和分离培养法两种检测方法皆为阳性有5份;两种检测方法皆为阴性有120份;LAMP法阳性而分离培养法为阴性有9份;分离培养法阳性而LAMP法为阴性有1份。LAMP法检测阳性率高于分离培养法(P=0.021),见表2。
3讨论
本研究中利用LAMP方法对实际食品标本的前增菌液进行核酸检测,并和平行检测的分离培养法进行了检出率的比较。结果显示,LAMP法检出率更高,达10.4%,而分离培养法只有4.4%,LAMP法检测阳性率更高。研究中参照的国家标准《食品微生物学检验沙门氏菌检验》[10]需要经过前增菌、增菌、分离、筛选可疑菌落、生化和血清学鉴定这几个步骤,得到阴性结果往往需要4d左右,检出沙门菌至少需要7d。
另外,分离培养法的生化鉴定存在繁琐或需要昂贵的全自动微生物鉴定系统的不足之处血清学分型也存在效价低、试剂昂贵和易失效等缺点不利于基层特别是区县疾病预防控制中心的使用。分离培养法需要经过两次增菌后再进行分离培养,而LAMP法检测只需要采用前增菌液进行核酸提取后即可开始LAMP扩增试验,在60min即可以完成LAMP扩增过程,本研究利用LAMP方法可以在24h(包括食品标本的前增菌过程)内检出食品标本中的沙门菌属,相比分离培养法更快速。另外,LAMP法还可以利用肉眼判断结果,比较直观方便,这对生鲜食品的快速检测具有重要意义。