2021-4-9 | 生物科学论文
在中学教材中关于“DNA的粗提取与鉴定”这一实验的实际操作过程中，虽然现象明显，但存在几个问题:实验材料成本高［1］;操作步骤较复杂;需要仪器较昂贵等。因此，一般中学很难开展［2］。针对上述问题，本实验做了部分改进，实验分别选用了新鲜的菜花和蒜黄作为材料，进行比较实验，试图达到材料来源广，试剂用量少，所需仪器少，操作更简单，结果较明显，一般普通中学均能开设的目的。从而有利该实验普及推广，让更多的中学生能从植物材料中提取DNA，增加学生的感性认识，提高学生的动手能力。
1材料和方法
(1)材料
菜花和蒜黄。
(2)实验方法
以经典的SDS提取方法［3］为对照:①分别称取在－20℃条件下保存的两种植物组织10g，在液氮的冷冻下迅速研磨成粉末。②加入提取液(100mMTris•HClpH8.5，100mMNaCl，50mMEDTApH8.0，2%SDS)20mL，充分研磨混匀，用两层纱布过滤，用移液器分别吸取5mL滤液于10mL的离心管中。③将离心管置于65℃水浴中30min，水浴过程中温和混匀几次。④取出离心管，每管加入等体积的氯仿-异戊醇(V/V=1∶1)溶液，混匀后，10000rpm离心10min。⑤小心将上清液移入另一离心管中，不要吸入杂质，重复步骤④，将上清液小心移入另一新的离心管中。⑥加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混匀，静置一段时间。6000rpm离心2min，倒去上清液，吹干。⑦用70%乙醇冲洗1次，然后用6000rpm离心2min。⑧吹干后加入2mL的100xTE，溶解。⑨贴上标签于－20℃冰箱保存。对照上述步骤对DNA提取做表1处理。
(3)鉴定DNA
①二苯胺鉴定法［4］吸取各种处理的DNA溶解液0.75mL于5mL的试管中，再加入0.75mL配好的二苯胺溶液，置于100℃沸水浴中10min，观察离心管中颜色的变化。二苯胺溶液中加入DNA后会变蓝，DNA所含量越多，蓝色就越深。②分光光度计鉴定法吸取各种处理的DNA溶解液0.5mL于比色皿中，加入1mL的水溶液，再在另一只同样的比色皿中加入1.5mL的水溶液作空白对照，测定不同处理的DNA在260nm和280nm处的吸光值［5］。
2实验结果与分析
(1)不同材料对DNA浓度的影响
菜花剪成小块不易研磨，可能存在研磨不充分，提取量少等问题，这样对DNA的浓度会有一定影响。而蒜黄剪成小段后，研磨明显比菜花充分，提取量较多，但蒜黄中含有的多糖物质较多，也会影响DNA的浓度。但就操作角度来看，采用蒜黄较好。
(2)不同处理方法对DNA提取的影响
温度、液氮、氯仿-异戊醇和离心机等都是影响DNA提取的重要因素。因此本实验采用不同的处理方法来探讨DNA的提取，以达到优化实验的目的。①温度对DNA提取很重要，低温能更好地保持DNA不降解，见表2。液氮可使材料研磨充分。②氯仿-异戊醇起到了抽提蛋白质的作用，能很好地去除所提溶液中的杂质，最后提出来的DNA浓度和纯度均较好。③用静置的方法代替离心机，比较符合现在许多中学的现状，即静置后小心用吸管吸取上清液转移到干净的小烧杯中，能够达到良好的提取效果。④加入异丙醇沉淀DNA，沉淀效果更好，而且用量是0.6倍的上清液的体积，菜花和蒜黄的效果都比较好，总体效果比加2倍体积的无水乙醇得到的沉淀更多。
(3)DNA鉴定
二苯胺鉴定法是中学常用的方法，此方法操作简单，现象明显。本实验中－20℃条件，氯仿-异戊醇的处理和异丙醇沉淀的DNA含量较多，能使二苯胺溶液变得较蓝。说明DNA含量较高，通过分光光度计检测260nm/280nm为1.75～2.0之间，纯度较高，达到实验的要求。
3讨论
提取DNA的方法有许多，常见的有CTAB法和SDS法等。但由于所用材料及中学实验条件的限制，所提取的效果不尽如人意［6］。本实验从中学实验条件着手，就DNA的SDS经典提取方法中有几处中学实验条件达不到的步骤做了不同处理。
经过反复实验，实验材料采用蒜黄和菜花，在－20℃条件下，采用静置的方法处理并用冷的异丙醇沉淀DNA，得到的DNA浓度和纯度都较高，已经能达到中学的要求，能较好地观察到提取出来的DNA。经过比较最终得到一种最适合于中学DNA提取实验的方法，即采用蒜黄为实验材料，在－20℃条件下，不用液氮，不用离心机而采用静置，加入氯仿-异戊醇的方法。