微生物酯酶的运用

０引言

酯酶（Ｅｓｔｅｒａｓｅｓ，ＥＣ３．１．１．Ｘ）是一种催化酯键水解和合成的酶的总称，水解时催化酯键产生甘油和脂肪酸；合成时，把酸的羧基与醇的羟基脱水缩合，产物为酯类及其他香味物质．它广泛存在于动物、植物和微生物中．动物胰脏酯酶和微生物酯酶是酯酶的主要来源．１８３４年Ｅｂｅｒｌｅ在兔胰脏中首次发现脂肪酶，微生物酯酶则以１９３５年Ｋｉｒｓｈ发现产脂肪酶的草酸青霉（ＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍＯｘａｌｉｃｕｍ）为最早．由于微生物资源丰富，同时利用微生物发酵产酶具有便于工业化生产等优点，微生物酯酶得到关注，并且已经广泛应用于农业、食品酿造、医药化学、污水处理和生物修复等领域，又由于酯酶的酶促反应具有较高的底物专一性、区域选择性或者对映选择性，它是合成手性化合物（如手性药物，农药等）的高效生物催化剂，微生物酯酶已成为研究热点．

１微生物酯酶的组成及来源

１．１酯酶的组成

酯酶主要包括脂肪酶（Ｌｉｐａｓｅ，ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ，ＥＣ３．１．１．３）和羧酸酯酶（ｃａｒｂｏｘｙｌｅｓｔｅｒａｓｅｓ，ａｒｂｏｘｙｌｅｓｔｅｒｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ，ＥＣ３．１．１．１）［１－２］，两者在生化方面没有本质区别，只是在底物特异性上，羧酸酯酶倾向于水解酰基链长度小的底物（≤１０），而脂肪酶倾向于水解酰基链长度大的底物（≥１０）［３－４］，在结构上，酯酶属于α／β水解酶超家族，具有Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ａｓｐ构成的催化中心三组合（ｃａｔａｌｙｔｉｃｔｒｉａｄ），其中Ｓｅｒ通常位于具有保守的Ｇｌｙ－Ｘａａ－Ｓｅｒ－Ｘａａ－Ｇｌｙ五肽结构内［１－２］．细菌脂肪酶又包括八大家族：ｔｒｕｅｌｉｐａｓｅ，ＧＤＳＬ，ＦａｍｉｌｙＩＩＩ，ｔｈｅｈｏｒｍｏｎｅ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｌｉｐａｓｅ（ＨＳＬ），ＦａｍｉｌｙＶ－ＶＩＩＩ，其中ｔｒｕｅｌｉｐａｓｅ又包括７个亚族ＳｕｂｆａｍｉｌｙＩ．１－Ｉ．７［２，５］．阿魏酸酯酶（Ｆｅｒｕｌｉｃａｃｉｄｅｓｔｅｒａｓｅ，ＥＣ．３．１．１．７３）又称为肉桂酸酯酶，是最近分离出一种酯酶，它是羧酸酯水解酶的一个亚类，它能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯键［６］．

１．２微生物酯酶的来源

在自然界中能产生酯酶的微生物资源是非常丰富的，从分类上看主要是真菌，真菌中主要是青霉、链孢霉、红曲霉、黑曲霉、黄曲霉、根霉、毛霉、酵母菌、犁头霉、须霉、白地霉和核盘菌等１２属２３种；其次是细菌，在细菌中主要是芽孢杆菌属、假单胞菌属以及伯克霍尔德菌属等；另外，放线菌中的个别种类也能产生一定量的酯酶．２产酯酶微生物的筛选及酶活力的测定一般筛选流程为：样品→富集培养→平板分离→平板初筛（观察透明圈）→摇瓶复筛（测酶活力大小），三油酸甘油酯是产酯酶微生物初筛加入培养基中的常用底物，因为初筛选用平板培养基，而在培养基中存在不互溶的油、水两相，所以要对它们先进行乳化，乳化剂可选用聚乙烯醇或者吐温．溴甲酚紫由于反应后ｐＨ变化显色，而ＲｈｏｄａｍｉｎｅＢ由于可以和分解后的物质结合形成显色物质，它们被用作常用指示剂加入培养基内［７］．对于酯酶活力的测定，常见方法有以下几种：酯酶活力比色法，即以对硝基苯酚为底物，分光光度计测定４００ｎｍ处吸光度值［７］；酯酶活力滴定法，以ＮａＯＨ滴定三醋酸甘油酯在酯酶作用下释放的醋酸来测定；α－乙酸萘酯比色法，即先绘制α－萘酚标准曲线，然后在ｐＨ１０的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液中，以α－乙酸萘酯为底物和粗酶液反应，在５９５ｎｍ处测其吸光度值［８］．

３微生物酯酶与基因克隆

随着分子生物学和宏基因组学的发展，越来越多的研究人员从不同环境样品中筛选产酯酶微生物，克隆酯酶基因，构建高产的基因工程菌为进行后续的工业化生产打下基础．其中的环境样品的主要来源是土壤以及海洋，特别是海洋环境样品，因为海洋环境包括低温、高温、高静水压、强酸、强碱以及营养条件极为贫乏的各种极端环境，微生物要在这样的环境中生存，生理结构、代谢方式等都会发生一系列改变，所以从海洋中筛选到的微生物可能具备某些特殊的代谢产物，另外低温酯酶的研究也十分广泛，近年来已纯化或克隆表达了从南北极、深海、高山冻土中分离到的低温微生物产生的低温脂肪酶，如菌株ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｒａｇｉＩＦＯ３４５８（ＰＦＬ），Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．ＫＢ７００Ａ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．Ｂ１１－１，Ａｅｒｏｍｏｎａｓｓｐ．ＬＰＢ４的脂肪酶［９－１２］．郑鸿飞等［１３］从青岛前海和胶州湾海区样品中分离到１株产酯酶活力和稳定性较高的菌株ＥＢ２１；邵铁娟等［１４］从２０００多份渤海海区海泥样品中分离出一株新型脂肪酶高产菌株ＢｏｈａｉＳｅａ－９１４５，经鉴定为适冷性海洋酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）；张金伟等［１５］从南极普里兹湾深海沉积物中筛选到一株产低温脂肪酶的菌株７１９５；林学政等［１６］从南大洋普里兹湾的水样中筛选到一株产低温脂肪酶的深海嗜冷菌２５１０１；ＪｅｏｎＪＨ等［１７］从南韩江华岛潮汐平原沉淀物宏基因文库中分离到一种耐盐的酯酶基因亚型；一个新的酯酶基因ｅｓｔＤＬ３０从冲积土宏基因组文库中被筛出，它由１５２４个核苷酸组成，编码的蛋白质又５０７个氨基酸组成，这个酯酶蛋白属于ｆａｍｉｌｙＶＩＩ［１８］；一个超表达的阿魏酸酯酶基因ｅｓｔＦ２７从土壤宏基因组文库中被筛出［１９］．

４微生物酯酶的应用

４．１在食品加工方面的应用

酯酶主要通过酯交换［２０］、水解［２１，２２］及合成化合物等方式应用于食品加工方面．固定化脂肪酶现在已用于芳香酯的合成，而低分子量芳香酯多呈天然水果味，它们广泛应用于食品、饮料等食品工业，Ｍｅｌｏ等［２３］研究用Ｒｈｉｚｏｐｕｓｓｐ．脂肪酶合成香茅醇芳香酯优化条件；利用酯酶使乳制品增香［２４］，在酿酒和食用醋的生产中，利用酯酶提高乙酸乙酯、乳酸乙酯等酯类的含量，使口感有明显提高；食用油脂精炼工艺中，借助微生物酯酶在一定条件下能催化脂肪酸与甘油之间的酯化反应，从而把油中的大量游离脂肪酸转变成中性甘油酯，提高了食用油的价值；脂肪酶在面包专用粉中还有面团调理的功能，使面包质地柔软，颜色更白；酯酶催化合成单甘脂［２５］是使用量最大的食品乳化剂；阿魏酸是天然抗氧化剂，也是近年来国际认知的防癌物质，广泛应用于食品原料中，目前已使用阿魏酸酯酶与其他酶协同从各种农作物副产品中提取阿魏酸［２６］，并且阿魏酸作为合成天然香兰素的前体，利用微生物方法产生香兰素，具有毒性低、安全性高的特点，应用于食品中．