2021-4-9 | 农业
转基因(transgene)是指将人工分离和修饰过的外源或内源基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体性状的可遗传修饰。生物体内染色体复制的过程中，两条染色体之间会发生同源重组，这一现象为转基因的实现提供了可能。然而同源重组会导致染色体缺失、异位和基因失活等不利于转基因哺乳动物生物学效应的稳定遗传。早在20世纪40年代，美国遗传学家McClintockB在研究玉米的遗传因子时发现，某些基因活性受到一些能在不同染色体间转移的控制因子(controllingelement)所决定，这些控制因子就是转座子。随着对昆虫的深入研究，已陆续发现一些可以用于哺乳动物转基因研究的转座子，它们分别是:piggyBac、hyperactiveSleepingBeauty(SB11)和Tol2［1］。在这三者中，piggyBac转座子识别位点5'-TTAA-3'，剪切和插入不留下印迹，且转座效率比其他两个高。与同源重组相比，高效位点特异性整合的非病毒载体-piggyBac转座子可能更有利于定点整合，此外，piggyBac转座子还是研究基因功能的一个很好的工具。
1piggyBac转座子的结构
来自粉纹夜蛾(Trichoplusiani)的piggyBac转座子全长2472bp，两端为13bp的反向末端重复序列(ITR)和19bp的亚末端重复序列(subR)，5'反向末端重复序列(ITR)与亚末端重复序列(subR)之间有31bp，3'反向末端重复序列(ITR)与亚末端重复序列(subR)之间有3bp(图1)［2］。piggyBac转座子末端和亚末端重复序列都是活性自主转座子必需的元件。在亚末端重复序列中有一个2.1kb的转录单位，其中有一个1.8kb的开放阅读框(ORF)，这个转录单位编码一个约64ku的转座酶［3］。转座酶介导piggyBac转座子剪切和插入宿主基因组中，实现转座。
2piggyBac转座子的转座
piggyBac转座子发生转座时，在转座酶的作用下，精确地剪切和重新插入宿主基因组中。在哺乳动物细胞中，piggyBac转座子表现出与在昆虫研究中具有相似的特性。
2.1piggyBac转座子的转座特点
在哺乳动物转基因过程中，外源基因在基因组中的定位，有利于分析阳性克隆细胞或生物体的基因功能及其生物学效应。然而，piggyBac转座子在转座酶的辅助下，特异性识别基因组中位点5'-TTAA-3'，并且在随机插入基因组的过程中，更倾向于插入基因的5'非翻译区［5］。外源基因插入宿主基因组的非编码区，使外源基因在体内得到表达，与同源重组相比，piggyBac转座子更有利于转基因哺乳动物的产生。piggyBac转座子在剪切和粘贴的过程中，会越过DNA的合成，而不影响到DNA的修复或复制。piggyBac转座子上的DNA发生甲基化时，其转座被抑制。在老鼠的胚胎肝细胞中，piggyBac转座子跳跃的频率比较高，载体系统在转染细胞后，通过反向PCR和Southernblot技术，在一些阳性克隆细胞中，可以检测到15个以上的拷贝数［4］。此外，piggy-Bac转座子倾向于在局部范围(≈100kb)内跳跃。
2.2piggyBac转座子的转座机制
转座酶能够识别转座子的末端反向重复序列并且在其3'端切开，同时在转座子的靶部位交错切开单链，它的5'突出末端与转座子的3'末端连接，形成Sharpin中间体。不同种类转座子形成与靶序列连接中间体的过程大致相同;随后步骤各不一样。RupakMitra等［6］推断piggyBac转座子的转座有4个步骤(图2)。第一步:双链断裂，在转座子3'末端与侧翼供体DNA之间产生一个切口，在转座子末端暴露具有活性的3'OH。第二步:3'OH作为一个亲核基团，它与互补链上侧翼供体DNA的4个核苷酸结合，在转座子末端产生了一个发夹，同时转座子从供体DNA上分离。侧翼供体DNA包含互补的5'-TTAA，延伸能再结合修复供体缺口，从而产生一个精确的剪切。第三步:转座酶破坏转座子末端的发夹结构，在离体线性的转座子的5'末端留下4个核苷酸的突出端，并且在转座子的末端再一次暴露3'OH。第四步，转座子末端的3'OH与靶位点的DNA共价连接。对piggyBac转座子的转座机制的了解，有利于更好的用于基础和应用研究。
3影响piggyBac转座子的转座因素
3.1转座酶
piggyBac转座酶是DDE重组酶超家族中的一员，在载体系统转染哺乳动物细胞中，转座子载体和转座酶载体之间剂量的不同会影响piggyBac转座子的转座效率。在一定剂量范围内，当转座子载体和转座酶载体的剂量同时增加时，转座子在宿主基因组的拷贝数会增加，然而，当增加转座酶载体的剂量时，pig-gyBac转座子发生转座的频率会下降。SareinaChiung-YuanWu等［1］发现piggyBac转座酶与GAL4DNA结合区域耦合会维持piggyBac转座子的转座活性。此外，在转座酶载体上，启动子的不同会影响转座酶的表达量，从而影响转座效率。
3.2细胞类型
并不是所有细胞类型都适用于piggyBac转座子载体进行转染，这主要参考细胞的传代培养和细胞活力等因素。piggyBac转座子载体系统最初运用于哺乳动物细胞研究时，选择的是哺乳动物的胚胎干细胞，就是根据哺乳动物的胚胎干细胞具有较高的细胞活力和无限增殖的潜能。DNA的复制触发细胞的分裂增殖，且DNA的复制通常发生在细胞分裂的G1/S期，转座子的转座一般发生在DNA复制的过程中。DNA复制时，双链解开，DNA聚合酶和DNA结合蛋白等会与单链结合，促使DNA复制。同时，RNA聚合酶和转录结合因子会触发转座酶的表达，在转座酶的存在下，转座子会在宿主基因组内发生跳跃。此外，载体上piggyBac转座子所介导的基因片段长度大小也会影响转座子插入和剪切的准确性，会影响转座子的整合位点数目。
4piggyBac转座子在哺乳动物转基因中的应用
piggyBac转座子介导的转基因已经在人和老鼠胚胎肝细胞上进行研究，且在成年老鼠细胞中，Gaussia荧光素酶(Gluc)基因表达持续时间超过2个月［7］。piggyBac转座子由于具有识别位点特异性和高效转座的特点已成功介导诱导多潜能老鼠肝细胞(iPSCs)的产生［8］。Chikara等［9］将Cre/LoxP系统与piggyBac转座子结合在老鼠上检测到大量顺式调控元件。Cre/LoxP系统与piggyBac转座子的结合在理论上消除了piggyBac转座酶对转座的干扰，然而，在实际操作过程中，却是难以避免的。昆虫作为一种模式动物，其研究已经很深入，或许我们可以借鉴Tarig等［10］的思路(图3)，将转座子载体进行改造，从而提高转座的稳定性。质粒是由两对相反的转座子末端组成，分别是A、B、C和D。这样就有4个潜在的转座子(A-D，A-B，C-D和C-B)。通过对标记基因M2的筛选，期望的A-D转座子插入到宿主基因组中。原理上，侧翼的A-B和C-D转座子通过再一次暴露在转座酶的环境下而被切除，最后插入的片段因为没有转座子的末端，所以转座酶对插入的片段没有剪切作用。