反硝化菌株TGR30的特征

随着农业经济的迅速发展，灌溉面积和灌溉用水量不断增加，化肥施用量也不断增加，由于灌溉技术落后和化肥的有效利用率较低，农田灌溉退水污染成为亟待解决的问题(曹仁林和贾晓葵，2001)。宁蒙灌区地处黄河中上游，年退水30亿m3，主要污染物为氮、磷和COD，其中造成超标污染物主要为氮(张爱平等，2008)，对灌区水环境和黄河水安全构成了严重影响。

人工湿地利用基质-微生物-植物这个复合生态系统，具有独特而复杂的净化机理(潘丽娟和阳小成，2008)，与传统的污水处理法相比具有基建、运行费用低，操作与维护简单等优点(梁继东等，2003)。微生物在人工湿地氮素的去除过程中发挥着关键作用，张列宇等(2010)认为，氨化-亚硝化-硝化-反硝化是湿地中脱氮的最主要途径。反硝化细菌的反硝化反应则是使硝酸盐氮重新回到大气的主要途径(方芳和陈少华，2010)，因此高效反硝化细菌的获得对人工湿地的构建，解决农灌退水污染具有重要意义。

研究表明，好氧反硝化细菌克服了传统的反硝化细菌只能在缺氧条件下进行反硝化作用的缺点，有氧生长，生长周期短，对高浓度的氮耐受力很强(Jooetal．，2005;周立祥等，2006)，好氧反硝化细菌的发现，为生物脱氮技术注入了新的活力。但是现在发现的好氧反硝化细菌为数不多(Patureauetal．，2000;黄运红等，2007;王弘宇等，2007)，而高效的好氧反硝化细菌则更少(朱晓宇等，2009)。已发现的菌株中假单胞菌属最为常见(李卫芬等，2011)，关于芽孢杆菌属的报道相对较少。本研究涉及的人工湿地示范基地建在内蒙古自治区巴彦淖尔市乌拉特前旗境内，所在环境条件恶劣，盐碱化程度较高，有关能够适应此环境的高效好氧反硝化芽孢杆菌的研究鲜见报道。

因此，本研究在天然湿地底泥中分离出高效好氧反硝化芽孢杆菌，对其进行生物学鉴定，确定其在分类学上的地位，并在实验室条件下对细菌反硝化特性进行系统的研究，充分认识湿地系统优势好氧脱氮芽孢杆菌的脱氮特性，为今后工程实践及强化微生物脱氮技术提供参考。

1材料与方法

1.1样品来源

2010年6月采自内蒙古巴彦淖尔市乌梁素海底泥，风干，保存于纸袋中。

1.2培养基

菌株分离培养基(NA):牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂20.0g，pH7.2～7.4，蒸馏水1000mL。硝酸盐还原产气培养基:牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，KNO31.0g，pH7.2～7.4，蒸馏水1000mL。种子培养基:葡萄糖10.0g，CaCl20.2g，MgSO4•7H2O0.5g，(NH4)2SO42.0g，KCl0.2g，乙酸钠3.32g，pH7.2～7.4，蒸馏水1000mL。反硝化基础培养基:KNO32g，MgSO4•7H2O1g，KH2PO40.5g，葡萄糖10g，pH7.2～7.4，蒸馏水1000mL。菌株生理生化鉴定培养基参照文献的方法(东秀珠和蔡妙英，2001)。

1.3芽孢杆菌的分离

称取1g样品放入装有9mL无菌水的试管中，80℃水浴20min，充分振荡混匀，取1mL到下一个同样的试管中，依次稀释得到各种浓度的菌悬液。分别取10－5～10－73个稀释梯度的稀释液0.1mL涂布于NA平板上，然后倒置于37℃培养箱中培养24h。挑取不同形态的单菌落转接至NA斜面上，37℃恒温培养24h，置于4℃冰箱保存备用。所挑取菌落同时在NA培养基平板上划线检验纯度。

1.4反硝化芽孢杆菌的筛选

将1.3分离得到的菌株进行硝酸盐还原试验，具体方法参照文献(东秀珠和蔡妙英，2001)。对于能利用硝酸盐并且产气的试验菌株接种到反硝化基础培养基，37℃，200r•min－1，摇床震荡培养，离心取上清，测定总氮含量。根据氮含量的变化进一步确定优势菌株。总氮的测定采用过硫酸钾氧化紫外分光光度法(魏复盛等，2002)。

1.5菌株TGR30的鉴定

1.5.1形态与生理生化鉴定菌株的形态学鉴定

与生理生化鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠和蔡妙英，2001)进行。

1.5.2基因组DNA的提取及16SrDNA鉴定

参考Kim等(1995)和Rainey等(1996)的方法提取细菌基因组DNA，以琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。扩增引物为通用引物(Claudiaetal．，2002)，正向引物27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’;反向引物1492R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR反应体系、扩增程序以及产物的检测参照胡朝松等(2009)方法。纯化后的PCR产物送宝瑞通生物技术(北京)有限公司测序分析。将测序结果用BLAST软件与GenBank中已登录的16SrRNA基因序列进行同源性比较，通过CLUSTALX和BIOEDIT等软件进行多重序列比对分析，并以Neighbor-joining法构建系统发育树(Sai-tou＆Nei，1987)。1.6反硝化细菌TGR30的反硝化特性测定方法

1.6.1碳源

主要考察醋酸钠、酒石酸钾钠、葡萄糖、蔗糖、柠檬酸三钠、可溶性淀粉、琥珀酸钠、甘露醇、麦芽糖、乳糖对菌株反硝化特性的影响。将不同碳源分别以2%的添加量代替反硝化基础培养基中的葡萄糖，同时有不加碳源的培养基作对照。将试验菌株经纯培养18h后按8%的接种量加入到添加不同碳源的发酵培养基中，37℃，200r•min－1摇床振荡培养66h后取样测定总氮含量。

1.6.2碳氮比

试验中C/N均以碳源与氮源的质量比计算。反硝化基础培养基中KNO3浓度始终为2g•L－1，添加1.6.1小节中的最优碳源，碳源添加量根据试验调整，其他成分不变。菌株培养方法以及取样测定方法同1.6.1。

1.6.3盐浓度

培养基中的盐浓度以NaCl的含量计，设0、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%8个梯度，将试验菌株经纯培养18h后，按8%的接种量接入培养基中，37℃，200r•min－1摇床振荡培养66h后取样测定总氮含量。